أيد هذا العمل "خدمة الصحة العامة" منح من "معاهد الصحة الوطنية" (T32 DA007097، R01AI096966، andUM1AI26617).

1-1 اليوم: تقطيع الأنسجة الطازجة والحضانة الأولية <ol><li>استخدام مشرط قطع الأنسجة الطازجة إلى قطع صغيرة (حوالي 0.5 سم من 0.5 سم). بشكل منفصل الصق كل الأنسجة للمكبس وتضمينها مع 3-5 مل من 4% ذوبان منخفضة [اغروس] في برنامج تلفزيوني. قم بتسمية المكبس مع المعلومات الأنسجة باستخدام ملصق. وضعها في حامل مبردة في دلو الجليد يصلب.</li>
	<li>بدوره على مبضع ومجموعة شنت سمك الفروع إلى 200 ميكرومتر. تثبيت شفرة حلاقة على مبضع وإدراج المكبس مع الأنسجة في حمام مبضع.</li>
	إعداد <li>مخزنة الفوسفات المالحة مع الهيبارين (برنامج تلفزيوني-ح) بإضافة 100 ميكروغرام/مل أو 18.7 يو/مليلتر الهيبارين إلى برنامج تلفزيوني للحفاظ على الجيش الملكي النيبالي والسماح التطبيقات المحتملة ايش المصب. ملء حمام مبضع، تغطي الأنسجة المضمنة، مع 100-120 مل من برود، عقيمة برنامج تلفزيوني ه. إضافة مكعبات الثلج ح برنامج تلفزيوني للحمام للحفاظ على درجة حرارة 0-2 ° جيم ابدأ مبضع وقطع الأنسجة إلى 200 ميكرومتر المقاطع. 
	ملاحظة: من المهم أن تبقى الأنسجة المبردة بالثلج لتقليل النشاط الخلوي داخل الأنسجة وسبب أنسجة جديدة أسهل للقسم عند هي مبردة. يمكن استخدام برنامج تلفزيوني وحدها إذا لم يكن هناك أي خطط للعش المصب.</li>
	<li>بدلاً من ذلك، لاستخدام الأنسجة التي لا تقطع مع مبضع (مثل الأمعاء والرئة)، مشرط أو شفرة حلاقة لقطع الأنسجة إلى شرائح رقيقة كأقرب ما يمكن من 200 مليميكرون.</li>
	<li>تسمية غطاء لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا مع معلومات العينة التجريبية والدوائر الأنسجة في الآبار المقابلة. استخدام مجموعة الرسام لنقل المقاطع إلى دائرة أنسجة في بئر صفيحة 24-جيدا زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1 مل من برود PBS-حاء 
	ملاحظة: ينبغي قبل الشروع في تلطيخ الدوائر الأنسجة القابلة لإعادة الاستخدام. يمكن إجراء استخدام أنبوب الحد الأقصى للأداة أسفل جولة البوليبروبيلين 14 مل الدوائر الأنسجة وأسلاك الشبكة. استخدام شفرة حلاقة حادة لقطع الجزء السفلي من أنبوب الحد الأقصى للأداة أسفل الجولة البوليبروبيلين 14 مل. قطع أسلاك شبكة في حلقة مفرغة لتناسب الثقب في الجزء السفلي من الأنبوب. الحرارة دائرة شبكة الأسلاك باستخدام موقد بنسن حتى وملتهب. تعيين دائرة شبكة الأسلاك إلى أسفل بسرعة كبيرة، ودفع الأنبوب على الشبكة. تحقق من أن أسلاك شبكة أمان تعلق على الجزء السفلي من الأنبوب وثم قطع بعناية الجزء العلوي من الأنبوب عند علامة 3 مل باستخدام شفرة حلاقة حادة. وضع يصل إلى 3 أقسام الأنسجة في كل دائرة الأنسجة، أو ما يصل إلى 1 سم 2 من أنسجة كل بئر. تبقى بئر فارغة واحدة على الأقل بين الآبار مع تركيبات مختلفة من الأجسام المضادة لتجنب التلوث عبر.</li>
	تيترامير <li>المضي قدما إلى المرحلة الابتدائية وجسم تلطيخ فورا بعد الانتهاء من نقل جميع قطع المقاطع إلى الدوائر الأنسجة. الحفاظ على الأقسام المغمورة وبرود في 1 مل ح برنامج تلفزيوني في جميع الأوقات.</li>
	<li>احتضان الفروع الأنسجة بين عشية وضحاها مع 0.5 ميكروغرام/مل مترافق FITC، محملة الببتيد MHC--أنا تيتراميرس المخفف في برنامج تلفزيوني-ح بمصل الماعز العادية 2% (خ ع). وتشمل الماوس أو الأجسام المضادة غير الأرانب الأخرى الموجهة إلى خارج الخلية [ابيتوبس] للفائدة في هذه الحضانة (مثل الفئران مكافحة CD8 أضداد المخفف 1: 500 في برنامج تلفزيوني-H مع 2% خ ع). ضع 1 مل من الأجسام المضادة المخفف في كل بئر- 
	ملاحظة: يجب توخي الحذر عند تحديد الأجسام المضادة CD8، كما يمكن أن يعزز بعض وبعضها يمكن أن تمنع tetramers MHC ملزمة لمستقبلات خلية تي 4 ، 21. جسم CD8 الإنسان مكافحة الفئران الموصوفة هنا غير مستقر، ويؤدي أحياناً إلى تلطيخ ضعيفة إلى حد ما. وهو يستخدم هنا لوسم الثلاثي لأنها الوحيدة غير الأرنب والماوس غير CD8 جسم اختبار تلك الخلايا التائية CD8 المكاك الريسوسي الملون.</li>
	<li>استخدام 1 مل من محلول لكل بئر لجسم الأولية واللاحقة كل إينكوبيشنز، والقيام بهذا وجميع إينكوبيشنز اللاحقة في 4 درجات مئوية، مع لوحات على منصة هزاز. 
	ملاحظة: الأنسجة أن التعويم الحر في الدائرة-</li>
</ol> 2. يوم 2: التثبيت وحضانة الثانوي <ol><li>بعد الاحتضان الابتدائي، يغسل كل غسل أبواب مرتين مع 1 مل ح برنامج تلفزيوني يبرد لمدة 20 دقيقة. القيام بذلك عن طريق نقل الدوائر الأنسجة إلى لوحة زراعة الأنسجة 24-آبار مختلفة التي تحتوي على 1 مل ح برنامج تلفزيوني مبردة في الآبار المقابلة. 
	ملاحظة: كن حذراً لا بالتنقيط محتويات من عينة تجريبية واحدة إلى أخرى عند الانتقال بين الدوائر الأنسجة. لجميع إينكوبيشنز اللاحقة ويغسل، وبالمثل نقل الدائرة الأنسجة لصفيحة نظيفة تحتوي على الحل المناسب. تأكد من رصد المقاطع في الدوائر الأنسجة أثناء إجراء للتأكد من أن الفروع لا تتعثر على الجانبين من الدوائر الأنسجة. إذا أنها، تدفع لهم العودة إلى الحل.</li>
	<li>إصلاح الأجزاء مع 1 مل بارافورمالدهيد 4% مخزنة في برنامج تلفزيوني جديد ح 2 في درجة حرارة الغرفة (عدم الإفراط وإصلاح). أغسل مع ح برنامج تلفزيوني الباردة مرتين للحد الأدنى 5 
	تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. 
	ملاحظة: إذا كان من الضروري استرجاع مستضد و permeabilization للكشف عن [ابيتوبس] داخل الخلايا، المستضدات يمكن استردادها بواسطة غلى المقاطع في 0.01 mol اليوريا بعد التثبيت بارافورمالدهيد.</li>
	تحويل الأقسام إلى لوحات الثقافة 24-البئر الذي يحتوي على 0.01 mol اليوريا <li>ووضع هذه اللوحات في فرن ميكروويف. غلى المقاطع ثلاث مرات لحوالي 10 s كل منهما، ليصبح مجموع 30 س. 
	ملاحظة: كن حذراً جداً، الغليان يمكن فرض الحل أبواب الخروج من الآبار. إذا حدث هذا، استخدم الرسام دفع الفروع من الجانبين من قاعة الأنسجة أو من غطاء اللوحة مرة أخرى إلى الجزء السفلي من الدائرة الأنسجة مناسبة.</li>
	<li>مسبق للاحتضان جسم الثانوية، بيرميبيليزي وكتلة أقسام الأنسجة التي تفرخ لهم في عرقلة الحل الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني-ح والمنظفات 0.3% (برنامج تلفزيوني-ح تي) 2% خ ع على الروك ح 1 في 4 ° C. إجراء إينكوبيشنز جسم اللاحقة مع خ ع PBS-H-T/2%-</li>
	<li>للاحتضان الثانوية، نقل المقاطع في الدوائر الأنسجة إلى الآبار تحتوي على الأرنب فيتك مكافحة جسم المخفف المضيفين في خ ع PBS-H-T/2%. تبني بين عشية وضحاها.</li>
	<li>استخدام كونتيرستينينج إجراء الماوس المضادة-CD20 جسم المخفف 1: 200 في خ ع PBS-H-T/2%. لاستخدام هذا الخيار، استرداد [ابيتوبس] إذا لزم الأمر، تتخلل الخلايا، وكتلة قبل هذه الحضانة، كما هو موضح أعلاه.</li>
</ol> 3. يوم 3: التعليم العالي حضانة <ol><li>بعد الحضانة الثانية، يغسل المقاطع ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني-ح في 4 درجات مئوية على الأقل 20 دقيقة</li>
	<li>القيام حضانة نهائي مع المناسبة المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة (مثل الماعز الأرنب المضادة مترافق أصفر مخضر والماعز لمكافحة الفئران مترافق صبغ أحمر الآن والماعز الصبغة الخضراء مترافق الماوس المضادة الأجسام المضادة المخفف 1:5، 000، 1:5، 000 000، و 1:2، على التوالي، في PBS-H-T/2% خ ع). تبني بين عشية وضحاها. 
	ملاحظة: عند هذه النقطة، الحضانة يمكن تمديد لمدة تصل إلى ثلاثة أيام إذا لزم الأمر. إبقاء أبواب تحميها من الضوء التفاف اللوحات في إحباط القصدير أثناء هذا إينكوالخطوة بيشن وبعد ذلك، وكما يروي الضوء فلوروفوريس.</li>
</ol> 4. يوم 4: تركيب الأبواب <ol><li>أغسل أقسام ثلاثة مرات في برنامج تلفزيوني-ح لمالا يقل عن 20 دقيقة 
	ملاحظة: إذا كان التخطيط المصب ايش 19، إصلاح المقاطع في بارافورمالدهيد 4% ح 1 تأمين تيتراميرس والأجسام المضادة في المكان، ويغسل المقاطع مرتين مع برنامج تلفزيوني-H لمدة 5 دقائق في كل. 
	تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.</li>
	استخدام <li>الرسام لنقل المقاطع إلى شريحة مجهر. احرص على عدم كزة الأنسجة كثيرا. معطف كل قسم مع الجلسرين/الجيلاتين يحتوي على آخر متوسط المتصاعدة التي تحتوي على فلوروفوري حافظة أو يبيغاللوكاتيشين البروبيل-ن 4 مغ/مل. تغطية مع ساترة.</li>
	<li>تخزين الشرائح في حاوية شريحة محمية بالضوء في-20 درجة مئوية. شطف لوحات زراعة الأنسجة وإزالة التسميات على الأغطية استخدام الكحول. 
	ملاحظة: يمكن إعادة استخدام اللوحات.</li>
</ol> 5. الحصول على صور المجهر [كنفوكل] <ol><li>التقاط صور عالية الدقة مع مجهر [كنفوكل]، باستخدام أشعة الليزر المناسبة ومرشحات لكل فلوروفوري ( الشكل 1 أ وب)- 
	ملاحظة: في هذا المثال، (انظر الجدول للمواد) استخدم مجهر [كنفوكل]. وجمعت الصور استخدام الليزر نانومتر 561 في السلطة 20% لخلايا تي محددة مستضد المسمى أصفر مخضر و 488 نانومتر الليزر بقوة 10% للأخضر المسمى ب CD20-الإعراب عن الخلايا 640 نانومتر الليزر بقوة 15% للخلايا التائية CD8 الأحمر المسمى الآن. واستخدمت 20 × الهدف وفتحه عددية من 0.8-</li>
	<li>تسلسلياً جمع فترات سلسلة z في 3 ميكرومتر (أو غيرها) في القنوات الثلاث في حقول متعددة 800 × 800 بكسل. بناء مونتاج من الحقول التي تم جمعها ( الشكل 1 -E). تسمية كل صورة المونتاج استناداً إلى المعلومات الشريحة المقابلة وحفظه للتحليل-</li>
	<li>القيام بتحليل الصورة الكمية باستخدام مجهر [كنفوكل] كل تحليل وتقدير حجم البرنامج أو استخدام إيماجيج-</li>
</ol> 6. التحليل الكمي للصورة ملاحظة: يمكن إنجاز التحليل الكمي الصورة باستخدام برامج التحليل والقياس الكمي مجهر [كنفوكل] أو باستخدام برنامج إيماجيج. واستخدمت هنا، إيماجيج على سبيل مثال-
المونتاج <ol><li>مفتوحة [كنفوكل] بواسطة سحبه إلى إطار إيماجيج ( الشكل 2A). 
	ملاحظة: يمكن مباشرة فتح ImageJ المونتاج جمعتها مجاهر [كنفوكل] مختلفة كثيرة. إذا كان لا يمكن فتح المونتاج مباشرة قبل إيماجيج، تصدير z-الفحص المحدد كملف TIFF لفتح ذلك</li>
	<li>مكررة z-الفحص المحدد للتحليل (&#34; صورة &#34;-&#62; &#34; المكررة &#34;) ( الشكل 2B).</li>
	<li>تقسيم قنوات مختلفة (&#34; صورة &#34;-&#62; &#34; اللون &#34;-&#62; &#34; تقسيم القنوات &#34;) ( الشكل 2).</li>
	رسم <li>دوروا للتحليل الكمي في القناة المقابلة يكون موضوعيا وإضافته إلى إدارة العائد على الاستثمار عن طريق الضغط على &#34; تي &#34; على لوحة المفاتيح. قياس المنطقة. 
	ملاحظة: يظهر مدير ImageJ دوروا المنطقة في 2 ميكرومتر ( الشكل 2D).</li>
	<li>ضبط fluorescence السطوع والتباين للقناة ليتم تحليلها (&#34; صورة &#34;-&#62; &#34; ضبط &#34;-&#62; &#34; السطوع/&#34;) ( الشكل 2E).</li>
	<li>تسطيح دوروا على الصورة (&#34; دوروا مدير &#34;-&#62; &#34; سطح &#34;) ( الشكل 2 واو)-</li>
	<li>تحديد الخلايا إيجابية في الصورة باستخدام &#34; متعددة النقاط &#34; أداة ( الشكل 2).</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4%28%2B%29+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li>
<li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432944">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HLA-DR%2A08032%2FE7+and+HLA-DR%2A0818%2FE7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4%2B+T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li>
<li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific%2C+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519(2014).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679(2014).</li>
<li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4%2B+T+Cells+in+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).</li>
<li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8%2B+cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li>
<li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0004131">Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).</li>
<li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV%CE%94nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8%2B+T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561(2009).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8%2B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li>
<li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

المحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة يوفر أداة أساسية لكشف وتميز، والتحديد الكمي للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في البيئات الأصلية مع السياق هياكل الأنسجة والخلايا الأخرى. هنا، يمكننا وصف إجراءات مفصلة للمحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة، متبوعاً بتحليل الصورة ال?...

خلايا T حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات المناعية، بما في ذلك كشف والقضاء على الخلايا المصابة بالفيروس، ومنع المناعة الذاتية، ومساعدة في الإنتاج ب-الخلايا والخلايا البلازما من الأجسام المضادة، وكشف والقضاء على الخلايا السرطانية. تطوير ببتيد/MHC الفئة الأولى تيترامير تلطيخ محددة مستضد خلايا CD8 تي1 ووضع عهدا MHC الفئة الثانية تيترامير تلطيخ الخلايا CD4 تي2 بالتدفق الخلوي أحدث ثورة في قدرتنا على دراسة وفهم إيمونوبيولوجي خلايا تي. بينما مفيدة للغاية لتحديد الكمية والنمط الظاهري محددة مستضد خلايا T، التدفق الخلوي لا تسمح للكشف عن توطين المكانية محددة مستضد خلايا تي إلى الخلايا والهياكل في الأنسجة، والحالية الأخرى تقنيات تفصيل لاستخراج الخلايا T اللازمة للتدفق الخلوي محدودة الفعالية في الأنسجة غير اللمفاوية3.
نحن وآخرون تطورت أساليب استخدام الطبقة MHC الببتيد-تحميل الأول والصف الثاني تيترامير أو الكواشف مولتيمير بوصمة عار محددة مستضد خلايا CD8 و CD4 T في الأنسجة4،5،،من67، 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-أساليب "هذه المحكمة الخاصة العراقية" السماح لتحديد موقع والوفرة، والنمط الظاهري لخلايا محددة مستضد CD8 و CD4 T في الأنسجة وتوفير وسيلة للكشف عن هذه الخلايا بالنسبة لخلايا وهياكل في الأنسجة أخرى. مجموعتنا وقد تستخدم على نطاق واسع MHC--أنا تيترامير تلطيخ لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز)-وفيروس نقص المناعة القردي (سيف)-الخلايا التائية CD8 محددة في الأنسجة اللمفاوية والأعضاء التناسلية والمستقيم اكتساب فهم لفيروس نقص المناعة البشرية وسيف إيمونوباثوجينيسيس وأن تحديد يرتبط التطعيم الناجحة استراتيجيات14،15،،من1617. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعنا أيضا أسلوب الذي يجمع بين المحكمة الخاصة العراقية في الموقع التهجين (العش) لتوطين والتحديد الكمي للخلايا التائية CD8 الخاصة بالفيروس والخلايا المصابة بالفيروس في الأنسجة وتحديد مستويات المستجيب للهدف في فيفو 18 , 19.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام MHC الببتيد-تحميل-أنا تيتراميرس وصمة عار محددة مستضد خلايا تي CD8 في أقسام الأنسجة الطازجة، إلى أنسجة كونتيرستاين استخدام المدينة، والتحديد الكمي للخلايا مع محددة تعمل في المقصورات الأنسجة محددة. هذه الإجراءات هي نفسها كما كانت تستخدمها لي et al., الذي حددنا الموقع والوفرة، والنمط الظاهري لخلايا تي سيف على حدة في الأنسجة اللمفاوية أثناء الإصابة المزمنة بسيف في ماكاكويس20في المنشور الذي صدر مؤخرا.
لتنفيذ هذا الإجراء، مقطوع الأنسجة الطازجة والمحتضنة بين عشية وضحاها مع MHC الببتيد-تحميل-أنا tetramers مترافق لجزيئات ثيوسيانات fluorescein (فيتك). ثم أنها ثابتة في بارافورمالدهيد. بعد تحديد الأنسجة، يتم تضخيمه الإشارة من MHC tetramers باستخدام الأجسام المضادة-فيتك أرنب والمحتضنة مع المعلمة فلوريسسينتلي أرنب المضادة الأجسام المضادة مفتش، وكذلك تضخيم الإشارة من تيتراميرس منضم. المدينة يستخدم بالاقتران مع المحكمة الخاصة العراقية لصفات محددة مستضد الخلايا T والخلايا المحيطة بها. الأجسام المضادة التي تعترف [ابيتوبس] على سطح الخلايا أو مدرجة في الفضاء خارج الخلية في الحضانة الأولية مع تيتراميرس. الأجسام المضادة التي تعترف بداخل الخلايا [ابيتوبس] تتطلب تخلل لجدار الخلية قبل التلوين. يتم تصويرها باستخدام مجهر [كنفوكل] أقسام النسيج الملون وتحليلها باستخدام البرمجيات [كنفوكل]. الخلايا المسماة كمياً باستخدام برامج الفحص المجهري [كنفوكل] أو إيماجيج. يمكن استخدام بروتوكول وصف وصمة عار أساسا أي خلية محددة مستضد تي CD8 في أي أنسجة للذي MHC--أنا تيتراميرس متوفرة.

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBL6391V</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Razor&amp;nbsp; blade</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather Disposable Scalpel</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Round paintbrush #2</td><td>PRINCETON ART &amp;amp; BRUSH CO.</td><td>4350R</td><td>Can trim as needed with razor</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

خلايا T حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات المناعية، بما في ذلك كشف والقضاء على الخلايا المصابة بالفيروس، ومنع المناعة الذاتية، ومساعدة في الإنتاج ب-الخلايا والخلايا البلازما من الأجسام المضادة، وكشف والقضاء على الخلايا السرطانية. تطوير MHC-تيترامير تلطيخ الخلايا T محددة مستضد تحليلها بواسطة التدفق الخلوي ثورة في قدرتنا على دراسة وفهم إيمونوبيولوجي خلايا تي. بينما مفيدة للغاية لتحديد الكمية والنمط الظاهري محددة مستضد خلايا T، التدفق الخلوي لا يمكن تحديد التعريب المكانية محددة مستضد تي الخلايا إلى الخلايا والهياكل في الأنسجة، وتقنيات التصنيف الحالية الأخرى لاستخراج تي الخلايا اللازمة للتدفق الخلوي محدودة الفعالية في الأنسجة غير اللمفاوية. في الموقع تلطيخ تيترامير MHC (IST) هو تقنية لتصور خلايا تي التي محددة لمولدات المضادات للفائدة في الأنسجة. في تركيبة مع إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة)، يمكن تحديد المحكمة العراقية الخاصة وفرة والموقع والنمط الظاهري لخلايا محددة مستضد CD8 و CD4 T في الأنسجة. هنا، نحن تصف وضع بروتوكول لوصمة عار وتعداد الخلايا التائية CD8 مستضد على حدة، مع تعمل محددة تقع داخل مقصورات الأنسجة محددة. هذه الإجراءات هي نفسها التي استخدمت في المنشور الذي صدر مؤخرا من لي et al.، بعنوان "الخلايا المنتجة" فيروس نقص المناعة القردي "في" المسام تقمع جزئيا "من CD8 الخلايا+ " في فيفو "." الأساليب المذكورة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لأنها يمكن استخدامها لترجمة، النمط الظاهري، وتحديد مقدار أساسا أي خلية CD8 T مستضد محددة تتوفر فيها MHC tetramers، في أي أنسجة.

الشكل 1 يبين كيفية جمع الصور [كنفوكل] باستخدام مجهر [كنفوكل]. الشكل 2 يوضح تحليل الصورة الكمية باستخدام إيماجيج. الشكلان 3 و 4 إظهار الممثل الصور من العقدة الليمفاوية الأنسجة من سيف إصابة المكاك الريسوسي ملطخة MHC tetramers، CD8 ال...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues at JoVE

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

وهنا يصف لنا أسلوب الذي يجمع في الموقع تيترامير MHC تلطيخ مع إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد الترجمة، والنمط الظاهري، وكمية محددة مستضد الخلايا في الأنسجة. هذا البروتوكول يستخدم لتحديد الخصائص المكانية والمظهرية لخلايا تي CD8 مستضد على حدة بالنسبة لنوع الخلية الأخرى والهياكل في الأنسجة.

في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

12.2K Views.  University of Minnesota. وهنا يصف لنا أسلوب الذي يجمع في الموقع تيترامير MHC تلطيخ مع إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد الترجمة، والنمط الظاهري، وكمية محددة مستضد الخلايا في الأنسجة. هذا البروتوكول يستخدم لتحديد الخصائص المكانية والمظهرية لخلايا تي CD8 مستضد على حدة بالنسبة لنوع الخلية ?...

Video: In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it is now well established that the immune infiltrate in human tumors can correlate with prognosis and response to therapy. The analysis of the immune infiltrate in the tumor microenvironment has become a major challenge for the classification of patients and the response to treatment.
The co-expression of inhibitory receptors such as Program Cell Death Protein 1 (PD1; also known as CD279), Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Cell Immunoglobulin and Mucin Containing Protein-3 (Tim-3; also known as CD366), and Lymphocyte Activation Gene 3 (Lag-3; also known as CD223), is a hallmark of T cell exhaustion. We developed a multiparametric in situ immunofluorescence staining to identify and quantify at the cellular level the co-expression of these inhibitory receptors. On a retrospective series of frozen tissue of renal cell carcinomas (RCC), using a fluorescence multispectral imaging technology coupled with an image analysis software, it was found that co-expression of PD-1 and Tim-3 on tumor infiltrating CD8+ T cells is correlated with a poor prognosis in RCC. To our knowledge, this represents the first study demonstrating that this automated multiplex in situ technology may have some clinical relevance.

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Studying tumor microenvironment may identify prognostic or predictive biomarkers of clinical response to immunotherapy. Presented here, is an innovative method based on in situ fluorescence multispectral imaging to analyze and count automatically various subpopulations of CD8+ T cells. This reproducible and reliable technique is suitable for large cohort analyses.

متعدد الفلورة التحليل والقياس الكمي ل Intratumoral PD-1+ CD8 تيم-3+ + تي الخلايا

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Cancer Research

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

المستضد CD4 + تصور معين باستخدام خلايا T MHC الدرجة الثانية Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Biology

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

زرع الورم لتقييم ديناميكيات الخلايا التائية CD8+ المتسللة للورم في الفئران

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

في الكشف الموضعي للخلايا CD4 T Autoreactive في الدماغ والقلب عن طريق التوافق النسيجي الرئيسية الدرجة الثانية مجمع Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

تقنية لتصور في الوقت نفسه للفيروسات محددة CD8 + الخلايا T والخلايا المصابة بالفيروسات في الموضع</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

تحليل قردي نقص المناعة CD8 للفيروسات محددة<sup&gt; +</sup&gt; خلايا تي في القرد قرود المكاك التي كتبها الببتيد-MHC-I Tetramer تلطيخ

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

الكمي المتزامن ل CD8 لمكافحة ناقلات الأمراض والتحوير-الخاصة بمكافحة+ تي الخلايا عن طريق MHC أنا تيترامير تلطيخ بعد التطعيم مع ناقل فيروسي

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

عزل وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في رئتي الفأر

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

تسليط الضوء على المؤلف: بروتوكول محسن للكشف عن الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في رئتي الفأر باستخدام Tetramers

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

تحديد الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد من رئتي الفأر مع الببتيد: رباعيات التوافق النسيجي المعقدة الرئيسية

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST