עבודה זו נתמכה על ידי שירותי הבריאות הציבוריים מעניקה מ מכוני הבריאות הלאומיים (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. יום 1: חלוקתה רקמות טריים, הדגירה העיקרי <ol><li>שימוש באזמל כדי טריים רקמות לחתוך לחתיכות קטנות (כ 0.5 ס מ בגובה 0.5 ס מ). בנפרד דבק כל רקמה פומפה, להטביע אותם עם 3-5 מ של agarose נמוך-להמיס 4% ב- PBS. תווית על הבוכנה עם המידע רקמות באמצעות מדבקה. תכניס אותו בעל צונן בתוך דלי קרח שבמהלכו.</li>
	<li>להפעיל את מיקרוטום ואת ערכת העובי של הסעיפים ל- 200 מיקרומטר. התקנה תער על מיקרוטום, הוספה הבוכנה רכוב עם רקמת באמבטיה מיקרוטום.</li>
	<li>להכין באגירה פוספט תמיסת מלח עם הפרין (PBS-H) על-ידי הוספת µg 100/mL או הפארין U/mL 18.7 PBS כדי לשמר את הרנ א ולא להתיר יישומים פוטנציאליים איש במורד הזרם. למלא את האמבטיה מיקרוטום, כיסוי הרקמה מוטבע, עם 100-120 מ של PBS-ה צוננת, סטרילי להוסיף קוביות קרח PBS-H לאמבטיה כדי לשמור על הטמפרטורה ב 0 - 2 ° C. התחל האזמל הקטן, חיתוך לרקמת למקטעים מיקרומטר 200. 
	הערה: חשוב לשמור על הרקמות מקורר על קרח כדי למזער את פעילות תאית בתוך הרקמות בגלל רקמת טריים שזה היה בסעיף זה הוא מקורר. PBS לבד יכול לשמש אם קיימות תוכניות עבור איש הזרם.</li>
	<li>לחילופין, ברקמות לא לחתוך עם מיקרוטום (למשל, בטן, ריאות), להשתמש באזמל או גילוח לחתוך את הרקמה לרצועות דק כמו קרוב ככל האפשר מיקרומטר 200.</li>
	<li>לתייג את המכסה של תרביות רקמה. ובכן 24 צלחות עם המידע מדגם ניסיוני ולמקם את תאי רקמת הבארות המתאימים. להשתמש במכחול כדי להעביר את המקטעים תא רקמת להגדיר בתוך הבאר של צלחת 24-ובכן תרביות רקמה המכיל 1 מ"ל של צונן PBS-ה 
	הערה: תאי רקמות לשימוש חוזר צריכה להיעשות לפני ייזום מכתים. רקמת תאי יכולים להתבצע באמצעות צינור snap-קאפ 14 mL סיבוב המדרגה פוליפרופילן, חוט רשת שינוי. השתמש סכין גילוח חדה לחתוך את החלק התחתון של צינור snap-קאפ 14 mL סיבוב המדרגה פוליפרופילן. חותכים רשת התיל במעגל כדי להתאים את החור בתחתית הצינורית. חום המעגל תיל רשת שינוי באמצעות מבער בונזן עד שזה לוהט. תניח את המעגל עם רשת שינוי חוט מהר מאוד ודחף את הצינורית על גבי רשת השינוי. בדוק כי רשת התיל הוא מחובר היטב לתחתית הצינור ואז בזהירות לחתוך את החלק העליון של הצינור-סימן 3 מ"ל באמצעות סכין גילוח חד. לשים עד 3 מקטעי רקמת לתא בכל רקמה, או עד 1 ס מ 2 של רקמות לכל טוב. לשמור היטב ריק אחד לפחות בין וולס עם שילובים נוגדנים שונים כדי למנוע זיהום צולב.</li>
	Tetramer <li>להמשיך למטרה העיקרית, נוגדן מכתים מיד לאחר שסיים את ההעברה של כל המקטעים לחתוך לתוך התאים ברקמות. לשמור על הסעיפים שקוע ולא מקורר ב 1 מ"ל של PBS-H כל הזמן.</li>
	<li>דגירה הסעיפים רקמות בין לילה עם 0.5 µg/mL FITC מצומדת, טעון-פפטיד MHC-אני tetramers מדולל ב- PBS-H עם 2% עז נורמלית בסרום (הגדרות). כוללות העכבר או נוגדנים אחרים-ארנב מכוונת epitopes חוץ-תאי של עניין זה דגירה (למשל, נוגדנים anti-CD8 עכברוש מדולל שבערך ב- PBS-H עם 2% המיתרים). מקום 1 מ"ל של נוגדנים מדולל היטב לכל. 
	הערה: כדאי לשים לב בעת בחירת CD8 נוגדנים, וגם כמה יכול לשפר כמה יכול לעכב MHC tetramers מחייב את T-cell קולטנים 4 , 21. הנוגדן CD8 נגד עכברוש המתוארים כאן אינו יציב, לפעמים התוצאות מכתים חלש במקצת. הוא משמש כאן עבור תיוג משולש כי היא היחידה שאינה-הארנב-עכבר CD8 נוגדן נבדק זה תאי CD8 T מקוק רזוס מוכתם.</li>
	<li>לנפש 1 מ"ל של פתרון טוב עבור נוגדן ראשוני ו incubations כל הסגירות העוקבות ולבצע זה ואת כל הבאים incubations ב 4 ° C, עם הצלחות על פלטפורמה נדנדה. 
	הערה: רקמות צריך מרחפים בחופשיות בחדר.</li>
</ol> 2. יום 2: קיבוע של דגירה משני <ol><li>לאחר הדגירה העיקרי, לשטוף המקטעים פעמיים עם 1 מ"ל PBS-H בקירור למשך 20 דקות כל כביסה. עושים זאת על ידי העברת רקמות התאים צלחת תרביות רקמה 24-ובכן שונים המכיל 1 מ"ל של PBS צוננת-H בהבארות המתאים. 
	הערה: יש להיזהר לא לטפטף התוכן מהדגימה ניסיוני אחת אחרת כשעוברים בין תאי רקמות. עבור כל incubations עוקבות, שוטף, בדומה להעביר תא רקמת צלחת נקי המכיל את הפתרון המתאים. הקפד לעקוב אחר בסעיפים רקמות התאים במהלך ההליך כדי לוודא כי הסעיפים לא להיתקע לצדדים של רקמות התאים. אם הם עושים, לדחוף אותם בחזרה לתוך הפתרון.</li>
	<li>לתקן את הסעיפים 1 מ"ל של טרי באגירה PBS 4% paraformaldehyde עבור 2 h בטמפרטורת החדר (לא יותר מדי לתקן). תשטוף עם PBS קר-H פעמיים במשך 5 דק 
	התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; ללבוש ציוד מגן אישי המתאים. 
	הערה: אם אחזור אנטיגן, permeabilization נחוצה כדי לזהות epitopes תאיים, אנטיגנים ניתן לאחזר הרתחה בסעיפים 0.01 מול אוריאה לאחר הקיבעון paraformaldehyde.</li>
	<li>להעביר את המקטעים לתוך תרבות. ובכן 24 צלחות המכיל mol 0.01 אוריאה ולמקם את הצלחות האלה בתנור מיקרוגל. מרתיחים את המקטעים שלוש פעמים במשך כ 10 s עבור סכום כולל של 30 ס' 
	הערה: להיות זהיר מאוד, כמו רותחים הפתרון יכול להכריח את המקטעים החוצה הבארות. אם זה קורה, להשתמש במברשת לדחוף הסעיפים צידי החדר רקמות או את המכסה של הצלחת בחזרה לתוך החלק התחתון של תא הרקמה המתאימה.</li>
	<li>מראש כדי הדגירה נוגדנים משניים, permeabilize וחסום את הסעיפים רקמות על ידי המקננת בהם בפתרון חסימה המכיל PBS-H, 0.3% דטרגנט (PBS-H-T) ו- 2% המיתרים על כיסא נדנדה עבור h 1-4 מעלות צלזיוס, בצע עוקבות נוגדן incubations עם הגדרות PBS-H-T/2%.</li>
	<li>עבור הדגירה המשני, להעביר הסעיפים בתאי רקמת וולס המכיל ארנב anti-FITC 1:10,000 נוגדנים מדולל ב PBS-H-T/2% המיתרים. דגירה בין לילה.</li>
	נוגדן אנטי-CD20 העכבר <li>באמצעות counterstaining בצע מדולל 1:200 ב PBS-H-T/2% המיתרים. עבור אפשרות זו, לאחזר את epitopes אם יש צורך, לחדור לתאים, לחסום לפני זה דגירה, כפי שתואר לעיל.</li>
</ol> 3. יום 3: הדגירה שלישוני <ol><li>לאחר הדגירה השני, לשטוף את הסעיפים 3 פעמים ב- PBS-H-4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 20 דקות</li>
	<li>לבצע דגירה הסופי עם המתאים fluorescently שכותרתו נוגדנים (למשל, ארנב נגד עז מצומדת צהוב ירקרק, צבע אדום רחוק מצומדת אנטי חולדה עז, עז אנטי-העכבר צבע ירוק מצומדת נוגדנים מדולל 1:5, 000, 1:5, 000, 1:2, 000, בהתאמה, בעוד PBS-H-T/2% המיתרים). דגירה בין לילה. 
	הערה: בשלב זה, הדגירה ניתן להרחיב עד שלושה ימים במידת הצורך. לשמור על הסעיפים מוגן מפני אור על ידי ליפוף הצלחות באלומיניום במהלך הזה incuשלב bation לאחר מכן, כמו אור המרווה fluorophores.</li>
</ol> 4. יום 4: הרכבה הסעיפים <ol><li>שטיפת הסעיפים שלוש פעמים ב- PBS-H לפחות 20 דקות 
	הערה: אם תכנון עבור איש הזרם 19, לתקן בסעיפים 4% paraformaldehyde לשעה כדי לאבטח את tetramers ואת נוגדנים במקום ולאחר מכן לשטוף את המקטעים פעמיים עם PBS-H למשך 5 דקות לכל. 
	התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; ללבוש ציוד מגן אישי המתאים.</li>
	<li>להשתמש במכחול כדי להעביר את המקטעים לשקופית מיקרוסקופ. יש להיזהר לא לדחוף את הרקמה מדי. מעיל כל מקטע עם גליצרול/הג'לטין המכיל מספר n-propyl 4 מ"ג/מ"ל או באמצעי הרכבה אחר המכיל את fluorophore של שימור. לכסות עם coverslip.</li>
	<li>לאחסן את השקופיות במיכל המוגן על-ידי אור שקופיות ב-20 מעלות צלזיוס. לשטוף את הצלחות תרביות רקמה ולהסיר את התוויות על עפעפיו באמצעות אלכוהול. 
	הערה: הלוחות ניתן להשתמש בהם.</li>
</ol> 5. רכישת תמונות מיקרוסקופ קונפוקלי <ol><li>לכידת תמונות ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, באמצעות לייזרים המתאים מסננים עבור כל fluorophore ( איור 1 א' ו ב'). 
	הערה: בדוגמה זו, מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה את הטבלה של חומרים) שימש. תמונות נאספו באמצעות הלייזר nm 561 ב 20% כוח של ירקרק התווית על-ידי צהוב אנטיגן ספציפי בתאי T, הלייזר 488-nm ב 10% כוח עבור התווית על-ידי ירוק לבטא CD20 B תאים של הלייזר 640-nm ב 15% כוח עבור תאי CD8 T מתויג אדום רחוק. 20 X אובייקטיבית, מפתח נומרי של 0.8 שימשו.</li>
	<li>ברצף לאסוף z-סדרה 3 מיקרומטר (או השני) מרווחי בערוצים שלושה שדות מרובים 800 x 800 פיקסלים. לבנות מצרף של השדות שנאספו ( איור 1C -E). שם כל תמונה מונטאז בהתבסס על המידע של השקופית המתאימה ולשמור אותה לניתוח.</li>
	<li>לבצע ניתוח התמונה כמותית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בהתאמה ניתוח, כימות התוכנה או באמצעות ImageJ.</li>
</ol> 6. כמותיים וניתוח תמונות הערה: ניתוח כמותי תמונות יכול להתבצע באמצעות ניתוח מיקרוסקופ קונפוקלי ותוכנות כימות או באמצעות תוכנת ImageJ. כאן, ImageJ שימש כדוגמה.
<ol><li>פתח קונאפוקלית מונטאז על-ידי גרירתה לחלון ImageJ ( איור 2 א). 
	הערה: ImageJ יכול לפתוח ישירות montages שנאספו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי שונים רבים. אם מונטאז לא ניתן לפתוח ישירות על-ידי ImageJ, לייצא את z-הסריקה שנבחרו כקובץ TIFF כדי לפתוח את זה</li>
	<li>לשכפל את הסריקה-z שנבחרו לניתוח (&#34; התמונה &#34;-&#62; &#34; לשכפל &#34;) ( איור 2B).</li>
	<li>לפצל את הערוצים השונים (&#34; התמונה &#34;-&#62; &#34; צבע &#34;-&#62; &#34; פצל ערוצים &#34;) ( איור 2C).</li>
	<li>לצייר את רועי לניתוח כמותי בערוץ המתאים כדי להיות אובייקטיבי ולהוסיף אותו למנהל רועי על ידי לחיצה על &#34; T &#34; בלוח המקשים. למדוד את השטח. 
	הערה: מנהל רועי ImageJ מציג את האזור מיקרומטר 2 ( איור דו-ממדי).</li>
	<li>להתאים את קרינה פלואורסצנטית הבהירות והחדות של הערוץ כדי להיות מנותח (&#34; התמונה &#34;-&#62; &#34; התאם &#34;-&#62; &#34; בהירות/ניגוד &#34;) ( איור 2E).</li>
	<li>לשטח את ההחזר על התמונה (&#34; רועי מנהל &#34;-&#62; &#34; לשטח &#34;) ( איור 2F).</li>
	<li>לכמת התאים חיובית התמונה באמצעות &#34; multi-point &#34; כלי ( איור 2G).</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4%28%2B%29+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li>
<li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432944">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HLA-DR%2A08032%2FE7+and+HLA-DR%2A0818%2FE7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4%2B+T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li>
<li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific%2C+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519(2014).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679(2014).</li>
<li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4%2B+T+Cells+in+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).</li>
<li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8%2B+cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li>
<li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0004131">Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).</li>
<li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV%CE%94nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8%2B+T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561(2009).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8%2B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li>
<li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

IST בשילוב עם IHC מספק כלי חיוני עבור זיהוי, אפיון לכימות אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T בסביבות מקורית עם ההקשר של תאים ומבנים רקמות אחרות. כאן, אנו המתואר הליכים מפורטים עבור IST בשילוב עם IHC, ואחריו ניתוח תמונה כמותית, כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T בבלוטות הלימפה של קופי מקוק ...

תאי T הם קריטיים לתהליכים אימונולוגי רבים, לרבות גילוי ו חיסול תאים הנגועים בנגיף, מניעת מחלת חיסון עצמי, סיוע בייצור תאי B ו פלזמה-cell של נוגדנים, איתור של חיסול תאים סרטניים. הפיתוח של פפטיד/MHC מחלקה אני tetramer מכתים של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים1 , התפתחות עדכנית יותר של MHC class II tetramer מכתימה של תאי CD4 T2 מאת cytometry זרימה מהפכה היכולת שלנו ללמוד ולהבין immunobiology של תאי T. בזמן מאוד שימושי לקביעת כמות של פנוטיפ של תאי T אנטיגן ספציפי, cytometry זרימה אינו מאפשר איתור לוקליזציה המרחבי של אנטיגן ספציפי בתאי T כדי תאים ומבנים אחרים ברקמות, ועדכניים disaggregation טכניקות כדי לחלץ את תאי T הדרושים עבור cytometry זרימה מוגבלת רקמות הלימפה3.
אנחנו ואחרים פיתחו שיטות שימוש טעון-פפטיד MHC class אני ו class II tetramer או multimer ריאגנטים כתם תאי CD8 ו- CD4 T אנטיגן ספציפי רקמות4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. שיטות אלה IST לאפשר הקביעה של מיקום, שפע, ותפקיד של CD8 אנטיגן ספציפי ותאי CD4 T ברקמות ולספק אמצעי לגילוי של תאים אלה ביחס תאים ומבנים אחרים ברקמות. הקבוצה שלנו השתמשה בהרחבה MHC-אני tetramer מכתים ללמוד וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) - וגם הקופי הכשל החיסוני (SIV) - תאי CD8 T ספציפיים ברקמות הלימפה, איברי המין, פי הטבעת כדי להשיג הבנה של השיגה SIV ו- HIV כדי לזהות בקורלציה של חיסון מוצלחת אסטרטגיות14,15,16,17. בנוסף, אנו גם פיתחו טכניקה שמשלב IST בבאתרו הכלאה (איש) כדי להתאים לשפה ולכמת בתאי CD8 T וירוס ספציפיים, תאים הנגועים בנגיף ברקמות וכדי לקבוע את רמות אפקטור-כדי-יעד ויוו 18 , 19.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות טעון-פפטיד MHC-אני tetramers כתם אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T בסעיפים רקמות טריים, עד counterstain רקמות באמצעות IHC ולאחר לכמת תאים עם פנוטיפים ספציפי בתאים רקמות ספציפיות. הליכים אלה הם בדיוק כמו Li. et al., שבו קבענו את מיקום שפע, ותפקיד של תאי T ספציפי SIV ברקמת הלימפה במהלך זיהום כרוני SIV קופי מקוק20שימש בפרסום האחרונה שלנו.
עבור הליך זה, רקמות טריים למחלקה, מודגרות בין לילה עם טעון-פפטיד MHC-אני tetramers מצומדת כדי מולקולות thiocyanate fluorescein (FITC). ואז הם קבועים ב- paraformaldehyde. לאחר תיקון הרקמה, האיתות tetramers MHC מוגבר באמצעות נוגדנים anti-FITC הארנב, מודגרות עם מתויגות fluorescently הארנב אנטי איג נוגדנים, נוסף להיקלט. מ tetramers מאוגד. IHC משמש בשילוב עם IST לאפיין אנטיגן ספציפי T תאים, התאים שמסביב. נוגדנים מזהה epitopes על פני השטח של תאים או בחלל חוץ-תאית כלולים הדגירה העיקרי עם tetramers. נוגדנים מזהה תאיים epitopes דורשים הסתננות של דופן התא לפני צביעת. הסעיפים רקמות מוכתמים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי וניתח באמצעות תוכנה קונפוקלי. תאים עם תוויות הם לכמת באמצעות תוכנה מיקרוסקופיה קונפוקלית או ImageJ. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי להכתים בעיקרו אנטיגן ספציפי CD8 T תא כלשהו ברקמה כלשהי עבור אילו MHC-אני tetramers הינם זמינים.

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBL6391V</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Razor&amp;nbsp; blade</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather Disposable Scalpel</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Round paintbrush #2</td><td>PRINCETON ART &amp;amp; BRUSH CO.</td><td>4350R</td><td>Can trim as needed with razor</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

תאי T הם קריטיים לתהליכים אימונולוגי רבים, לרבות גילוי ו חיסול תאים הנגועים בנגיף, מניעת מחלת חיסון עצמי, סיוע בייצור תאי B ו פלזמה-cell של נוגדנים, איתור של חיסול תאים סרטניים. הפיתוח של MHC-tetramer מכתים של תאי T אנטיגן ספציפי נותחו על ידי cytometry זרימה יש מהפכה היכולת שלנו ללמוד ולהבין את immunobiology של תאי T. בזמן מאוד שימושי לקביעת כמות של פנוטיפ של תאי T אנטיגן ספציפי, cytometry זרימה אין אפשרות לקבוע את ההתאמה המרחבית של אנטיגן ספציפי בתאי T תאים אחרים, מבנים רקמות וטכניקות disaggregation הנוכחי כדי לחלץ את ה-T תאים הדרושים עבור cytometry זרימה מוגבלת ברקמות שאינן הלימפה. בחיי עיר MHC-tetramer מכתים (IST) היא טכניקה להמחיש T תאים ספציפיים עבור אנטיגנים עניין ברקמות. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה (IHC), IST ניתן לקבוע את השפע, מה מיקומם ואילו פנוטיפ של אנטיגן ספציפי תאי CD8 ו- CD4 T ברקמות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להכתים ולספור תאי CD8 T אנטיגן ספציפי, עם פנוטיפים ספציפי ממוקם בתוך תאי רקמות ספציפיות. הליכים אלה זהים פעם בפרסום האחרונה שלנו מאת Li. et al., שכותרתו "תאים מייצרי בנגיף זקיקים מדוכאים באופן חלקי על ידי CD8+ תאים Vivo ב." בשיטות המתוארות חלים באופן כללי כי הם יכולים לשמש כדי להתאים לשפה, פנוטיפ, ולכמת למעשה כל אנטיגן ספציפי CD8 תא T שעבורו MHC tetramers זמינים, כל רקמה.

איור 1 מראה כיצד לאסוף תמונות קונאפוקלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. איור 2 מדגים ניתוח התמונה כמותית באמצעות ImageJ. דמויות 3 ו- 4 הצג נציג תמונות של רקמות הלימפה סיב נגוע מקוק רזוס צבעונית עם MHC tetramers, נוגדנים CD8 נוגדנים CD20, ו?...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues at JoVE

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת בחיי עיר MHC-tetramer מכתים עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע לוקליזציה, פנוטיפ וכמות תאי T אנטיגן ספציפי ברקמות. פרוטוקול זה משמש כדי לקבוע את המאפיינים המרחבי, פנוטיפי של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T ביחס אחרים סוג התא ומבני ברקמות.

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

12.2K Views.  University of Minnesota. כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת בחיי עיר MHC-tetramer מכתים עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע לוקליזציה, פנוטיפ וכמות תאי T אנטיגן ספציפי ברקמות. פרוטוקול זה משמש כדי לקבוע את המאפיינים המרחבי, פנוטיפי של אנטיגן ספציפי בתאי CD8 T ביחס אחרים סוג התא ומבני ברקמות.

Video: In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it is now well established that the immune infiltrate in human tumors can correlate with prognosis and response to therapy. The analysis of the immune infiltrate in the tumor microenvironment has become a major challenge for the classification of patients and the response to treatment.
The co-expression of inhibitory receptors such as Program Cell Death Protein 1 (PD1; also known as CD279), Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Cell Immunoglobulin and Mucin Containing Protein-3 (Tim-3; also known as CD366), and Lymphocyte Activation Gene 3 (Lag-3; also known as CD223), is a hallmark of T cell exhaustion. We developed a multiparametric in situ immunofluorescence staining to identify and quantify at the cellular level the co-expression of these inhibitory receptors. On a retrospective series of frozen tissue of renal cell carcinomas (RCC), using a fluorescence multispectral imaging technology coupled with an image analysis software, it was found that co-expression of PD-1 and Tim-3 on tumor infiltrating CD8+ T cells is correlated with a poor prognosis in RCC. To our knowledge, this represents the first study demonstrating that this automated multiplex in situ technology may have some clinical relevance.

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Studying tumor microenvironment may identify prognostic or predictive biomarkers of clinical response to immunotherapy. Presented here, is an innovative method based on in situ fluorescence multispectral imaging to analyze and count automatically various subpopulations of CD8+ T cells. This reproducible and reliable technique is suitable for large cohort analyses.

מרובב ניתוח Immunofluorescence, כימות של CD8 טים-3+ PD-1+ Intratumoral+ T תאים

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Cancer Research

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Biology

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

השתלת גידול להערכת הדינמיקה של תאי T המסתננים לגידולים CD8+ בעכברים

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

באתרו איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

טכניקה במקביל דמיינו ספציפיות וירוס CD8 + T ו-תאים הנגועים בווירוס תאים באתרו</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian<sup&gt; +</sup&gt; T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

כימות סימולטני של CD8 וקטור נגד ו- Anti-transgene-ספציפי+ T תאים דרך MHC אני Tetramer מכתים לאחר החיסון עם וקטור ויראלי

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

בידוד ואפיון תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכבר

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

Author Spotlight: פרוטוקול ממוטב לאיתור תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכבר באמצעות טטרמרים

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST