Este trabajo fue apoyado por becas de servicio de salud pública de los institutos nacionales de salud (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. día 1: secciones de tejido fresco e incubación primaria <ol><li>uso de un bisturí para cortar tejido fresco en trozos pequeños (aproximadamente 0,5 cm de ancho por 0,5 cm de altura). Por separado cada tejido de un émbolo del pegamento e incrustarlos con 3-5 mL de agarosa de baja fusión de 4% en PBS. El émbolo de la etiqueta con la información de tejido con una pegatina. Poner en un porta frío en un cubo de hielo para solidificar.</li>
	<li>Encienda el micrótomo y el espesor de las secciones a 200 μm. Instale una cuchilla de afeitar en el micrótomo e Inserte el émbolo montado con el tejido en el baño de micrótomo.</li>
	<li>Preparación de solución salina con tampón fosfato con heparina (PBS-H) mediante la adición de 100 μg/mL o 18.7 de U/mL heparina para PBS para preservar el RNA y permitir aplicaciones de ISH potenciales aguas abajo. Llene la bañera de micrótomo, cubriendo el tejido embebido, con 100-120 mL de PBS estéril, refrigerado-H. Añadir cubitos de hielo de PBS-H al baño para mantener la temperatura a 0 - 2 ° C. arranque el microtomo y cortar el tejido en 200 secciones μm. 
	Nota: Es importante mantener los tejidos refrigerados en hielo para minimizar la actividad celular dentro de los tejidos y porque el tejido fresco es más fácil a la sección cuando se enfría. PBS solo puede usarse si no hay planes para ISH abajo.</li>
	<li>, Tejidos que no corte bien con un micrótomo (p. ej., intestino y pulmón), usar un bisturí o navaja para cortar el tejido en tiras finas como cerca posible de 200 μm.</li>
	<li>Etiqueta de la tapa de las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos con la información de la muestra experimental y las cámaras de tejido en los pocillos correspondientes. Refrigerados de uso un pincel para transferir las secciones a una cámara de tejido situado en el pozo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contienen 1 mL de PBS-H. 
	Nota: Cámaras de tejido reutilizable deben hacerse antes de iniciar la coloración. Cámaras de tejido pueden ser hechas usando un tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fondo redondo y malla de alambre. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar la parte inferior de un tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fondo redondo. Cortar la malla de alambre en un círculo para el agujero en la parte inferior del tubo. El círculo de malla de alambre con un mechero de Bunsen hasta que esté al rojo vivo de calor. Establecido muy rápidamente el círculo de malla de alambre y empuje el tubo dentro de la malla. Compruebe que el acoplamiento de alambre está fijado firmemente a la parte inferior del tubo y luego con cuidado cortar la parte superior del tubo en la marca de 3 mL con una cuchilla de afeitar. Puesto hasta 3 secciones de tejido en cada cámara de tejido, o hasta 1 cm 2 de tejido por pozo. Mantener al menos un pozo vacío entre pozos con combinaciones de anticuerpos diferentes para evitar la contaminación cruzada.</li>
	Tetrámero de <li>proceder a la primaria y el anticuerpo tinción inmediatamente después de terminar a la transferencia de todas las secciones de corte en los compartimientos de los tejidos. Mantener las secciones sumergidas y enfría en 1 mL de PBS-H en todo momento.</li>
	<li>Incubar las secciones de tejido durante la noche con 0,5 μg/mL de conjugado de FITC, cargado de péptido MHC-I tetrámeros diluidos en PBS-H con 2% de suero de cabra normal (NGS). Incluyen mouse u otros no conejo anticuerpos dirigidos a epítopes extracelulares de interés en la incubación (por ejemplo, los anticuerpos anti-CD8 rata diluyeron 1: 500 en PBS-H con el 2% NGS). Ponga 1 mL de anticuerpos diluidos en cada pocillo. 
	Nota: Debe tenerse cuidado al seleccionar anticuerpos CD8, y algunos pueden mejorar algunos pueden inhibir tetrámeros de MHC binding a receptores de células T 4 , 21. El rata anti-CD8 anticuerpo descrito aquí es inestable y a veces resulta algo débil de la tinción. Se utiliza para el etiquetado triple porque es el único no-conejo y CD8 anticuerpos de ratón no probaron eso células de T CD8 de macaco rhesus manchada.</li>
	<li>1 mL de solución por pozo para el anticuerpo primario e incubaciones posteriores y realizar esto y todas las incubaciones posteriores a 4 ° C, con las placas en una plataforma oscilante. 
	Nota: Los tejidos deben flotar libremente en la cámara de.</li>
</ol> 2. Día 2: Fijación e incubación secundario <ol><li>después de la incubación primaria, lavar las secciones dos veces con 1 mL de PBS-H refrigerado por 20 min cada colada. Ello mediante la transferencia de las cámaras de tejido a una placa de cultivo de tejidos de diferentes 24 pocillos que contienen 1 mL de PBS-H refrigerado en los pozos correspondientes. 
	Nota: Tenga cuidado de no gotear el contenido desde una muestra experimental en otro cuando se mueve entre compartimientos de tejido. Para todas las incubaciones posteriores y lavados, igualmente la transferencia de la cámara de tejido a un plato limpio con la solución adecuada. Asegúrese de supervisar las secciones de las cámaras de tejido durante el procedimiento para asegurarse de que las secciones no se atascan a los lados de las cámaras de tejido. Si ellos, empuje hacia dentro la solución.</li>
	<li>Fijar las secciones con 1 mL de fresco con tampón PBS paraformaldehído al 4% durante 2 h a temperatura ambiente (no demasiado fix). Lavado con PBS-H frío dos veces por 5 min 
	PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar equipo de protección personal. 
	Nota: Si se necesita recuperación de antígeno y permeabilización para detectar epítopos intracelulares, antígenos pueden recuperar hirviendo las secciones en 0.01 urea mol después de la fijación de paraformaldehido.</li>
	<li>Transferencia de las secciones en placas de 24 pocillos de cultivo que contiene 0,01 mol urea y colocar estas placas en un horno de microondas. Hervir las secciones tres veces para unos 10 s cada uno, para un total de 30 s. 
	Nota: Tenga mucho cuidado, como punto de ebullición la solución puede forzar las secciones de las fuentes. Si esto ocurre, utilice un pincel para rechazar las secciones de los lados de la cámara de tejido o de la tapa de la placa en la parte inferior de la cámara de tejido adecuada.</li>
	<li>Previo a la incubación del anticuerpo secundario, permeabilizar y bloquear las secciones de tejido por incubación en solución de bloqueo que contiene PBS-H, 0,3% detergente (PBS-H-T) y 2% NGS en un eje de balancín por 1 h a 4 ° C. realizar anticuerpos posterior las incubaciones con PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>Para la incubación secundaria, la transferencia de las secciones en las cámaras de tejido para pozos con conejo anti-FITC anticuerpos diluidos 1: 10,000 en PBS-H-T/2% NGS. Incubar durante una noche.</li>
	Anticuerpo anti-CD20 de <li>realizar counterstaining usando ratón diluido 1: 200 en PBS-H-T/2% NGS. Para esta opción, recuperar los epitopos si es necesario, impregnan las células y bloquear antes de la incubación, como se describe arriba.</li>
</ol> 3. Día 3: Incubación terciario <ol><li>después de la segunda incubación, lavar las secciones tres veces en PBS-H a 4 ° C durante al menos 20 min</li>
	<li>Realizar una incubación final con la correspondiente etiqueta fluorescente anticuerpos (por ejemplo, cabra anti-conejo conjugado amarillo verdoso, conjugados mucho rojo tinte de cabra anti-rata y cabra anti-ratón conjugado colorante verde anticuerpos diluido 1:5, 000, 1:5, 000 y 1:2, 000, respectivamente, en PBS-H-T/2% NGS). Incubar durante una noche. 
	Nota: en este punto, la incubación puede prolongarse hasta tres días si es necesario. Mantener las secciones protegidas de la luz envolviendo las placas en papel de aluminio durante este incupaso de bation y después de eso, como la luz apaga fluoróforos.</li>
</ol> 4. Día 4: Montaje de las secciones <ol><li>lavado las secciones tres veces en PBS-H por al menos 20 min 
	Nota: Si se planifica abajo ISH 19, fije las secciones en paraformaldehído al 4% durante 1 hora para asegurar los tetrámeros y anticuerpos en el lugar y luego lavar las secciones dos veces con PBS-H por 5 min. 
	PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar equipo de protección personal.</li>
	<li>Utilizar un pincel para transferir las secciones en un portaobjetos de microscopio. Tenga cuidado de no meter demasiado el tejido. Cubra cada sección con glicerol/gelatina que contenga 4 mg/mL n-propil galato u otro medio de montaje que contiene un conservante fluoróforo. Cubrir con un cubreobjetos.</li>
	<li>Guardar las diapositivas en un recipiente de deslizamiento protegido de la luz-20 º C. lavar las placas de cultivo de tejidos y eliminar las etiquetas de las tapas con alcohol. 
	Nota: Las placas se pueden reutilizar.</li>
</ol> 5. Adquisición de imágenes de Microscopio Confocal <ol><li>captura imágenes de alta resolución con un microscopio confocal, utilizando el láser adecuado y filtros para cada fluoróforo ( figura 1A y B). 
	Nota: En este ejemplo (véase la Tabla de materiales) utilizaron un microscopio confocal. Se obtuvieron imágenes utilizando el láser 561 al 20% de potencia para el verdoso amarillo marcado antígeno específicos de células T, el láser de 488 nm en el 10% de energía para las células B expresan CD20 marcado con verde y el láser de 640 nm en 15% de energía para las células T CD8 ahora marcado con rojo. Se utilizaron 20 X objetivo y una apertura numérica de 0.8.</li>
	<li>Recoger secuencialmente intervalos de la serie z a 3 μm (u otro) en los tres canales en los múltiples campos de 800 x 800 píxeles. Construir un montaje de los campos recogidos ( figura 1 -E). Nombre de cada imagen de montaje basado en la información de la diapositiva correspondiente y guardar para análisis.</li>
	<li>Realizar análisis cuantitativo de imagen utilizando el software de análisis y cuantificación de microscopio confocal respectivos o ImageJ.</li>
</ol> 6. Análisis de imagen cuantitativo Nota: Análisis de imagen cuantitativo pueden lograrse usando software de análisis y cuantificación de microscopio confocal o usando el software ImageJ. Aquí, ImageJ fue utilizado como ejemplo.
Montaje <ol><li>abierto un confocal arrastrándolo a la ventana de ImageJ ( figura 2A). 
	Nota: ImageJ puede abrir directamente montajes recopilados por muchos diferentes microscopios confocales. Si el montaje no puede ser abierto directamente por ImageJ, exportar el z-scan seleccionado como un archivo TIFF para abrir it</li>
	<li>Duplicar el seleccionado z-scan para el análisis (&#34; imagen &#34;-&#62; &#34; duplicados &#34;) ( figura 2B).</li>
	<li>Divide los diferentes canales (&#34; imagen &#34;-&#62; &#34; Color &#34;-&#62; &#34; Split canales &#34;) ( figura 2).</li>
	<li>Dibujar el ROI para el análisis cuantitativo en el canal correspondiente para ser objetivo y añadir al Gerente de ROI pulsando &#34; T &#34; en el teclado. Medir el área de. 
	Nota: El administrador de ROI de ImageJ muestra el área en el μm 2 ( Figura 2D).</li>
	<li>Ajustar el brillo de la fluorescencia y contraste del canal a ser analizados (&#34; imagen &#34;-&#62; &#34; ajuste &#34;-&#62; &#34; brillo/contraste &#34;) ( Figura 2E).</li>
	<li>Aplanar el ROI en la imagen (&#34; manager de ROI &#34;-&#62; &#34; aplane &#34;) ( figura 2F).</li>
	<li>Cuantificar las células positivas en la imagen usando el &#34; multipunto &#34; herramienta ( figura 2).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

IST combinado con IHC proporciona una herramienta esencial para detectar, caracterizar y cuantificar las células de T CD8 específica de antígeno en ambientes nativos con el contexto de otras células y estructuras del tejido. Aquí, describimos los procedimientos detallados para IST combinado con IHC, seguido por análisis de imagen cuantitativo, para determinar la localización, abundancia y fenotipo de las células de T CD8 específica de antígeno en nodos de linfa de macaques del macaco de la India. Coloración si...

Las células T son esenciales para muchos procesos inmunológicos, incluyendo la detección y eliminación de células infectadas por virus, previniendo autoinmunidad, ayudando en la producción de células B y células plasmáticas de anticuerpos y detectar y eliminar las células cancerosas. El desarrollo del péptido/MHC clase I tetrámero tinción de antígenos específicos de las células T CD81 y el más reciente desarrollo de MHC clase II la tinción de tetrámero de T CD4 células2 por citometría de flujo revolucionó nuestra capacidad para estudiar y comprender la Inmunobiología de las células. Mientras que extremadamente es útil para determinar la cantidad y el fenotipo de las células T específicas de antígeno, citometría de flujo no permite la detección de la localización espacial de las células antígeno específicas a otras células y estructuras en los tejidos y actual técnicas de desagregación para extraer las células T necesitan para citometría de flujo han limitado eficacia en tejidos no linfoides3.
Nosotros y otros hemos desarrollado métodos cargados de péptido MHC de clase I y clase tetrámero II multimer reactivos o para teñir las células CD8 y CD4 T específica de antígeno en los tejidos4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST estos métodos permiten la determinación de la localización, abundancia y fenotipo de las células CD8 y CD4 T específica de antígeno en los tejidos y proporcionar un medio para la detección de estas células en comparación con otras células y estructuras en los tejidos. Nuestro grupo ha utilizado extensivamente la MHC-I tetrámero tinción para estudio de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) - y virus de la inmunodeficiencia símica (VIS) - células T CD8 específicas en tejidos linfoides, genitales y rectales para obtener un entendimiento de la inmunopatogénesis del VIH y SIV e identificar correlatos de vacunación exitoso estrategias14,15,16,17. Además, también desarrollamos una técnica que combina IST con hibridación en situ (ISH) para localizar y cuantificar virus específicos de células T CD8 y células infectadas por virus en los tejidos y para determinar los niveles de efector a destino en vivo 18 , 19.
Aquí, describimos un protocolo usando cargado de péptido MHC-I tetrámeros para teñir las células de T CD8 específica de antígeno en secciones de tejido fresco, hasta tejidos de contratinción con IHC y cuantificar las células con fenotipos específicos en compartimientos de tejido específico. Estos procedimientos son los mismos que fueron utilizados en nuestra reciente publicación por Li et al., en el que se determinaron la localización, abundancia y fenotipo de células T específicas de la SIV en tejido linfoide durante la infección crónica de vis en macacos20.
Para este procedimiento, los tejidos frescos son seccionados y se incubó toda la noche con carga de péptido MHC-I tetrámeros conjugan con moléculas de tiocianato de fluoresceína (FITC). Luego están fijados en paraformaldehido. Después de fijar el tejido, la señal de los tetrámeros de MHC se amplifica usando conejo anti-FITC anticuerpos y se incubaron con fluorescente etiquetados anticuerpos de IgG de Anti-conejos que más amplifican la señal de los tetrámeros encuadernados. IHC se usa junto con IST para caracterizar antígenos específicos de células T y las células circundantes. En la incubación primaria con los tetrámeros se incluyen anticuerpos que reconocen epítopos en la superficie de las células o en el espacio extracelular. Anticuerpos que reconocen epítopos intracelulares requieren permeabilidad de la pared celular antes de la tinción. Las secciones de tejidos teñidos son imágenes con un microscopio confocal y analizan usando el software confocal. Las células marcadas se cuantifican mediante microscopía confocal software o ImageJ. El protocolo descrito se puede utilizar para manchar esencialmente cualquier célula T CD8 específica de antígeno en los tejidos para que MHC-I tetrámeros están disponibles.

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBL6391V</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Razor&amp;nbsp; blade</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather Disposable Scalpel</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Round paintbrush #2</td><td>PRINCETON ART &amp;amp; BRUSH CO.</td><td>4350R</td><td>Can trim as needed with razor</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

Las células T son esenciales para muchos procesos inmunológicos, incluyendo la detección y eliminación de células infectadas por virus, previniendo autoinmunidad, ayudando en la producción de células B y células plasmáticas de anticuerpos y detectar y eliminar las células cancerosas. El desarrollo de la tinción de tetrámero de MHC de las células antígeno específicas analizadas por citometría de flujo ha revolucionado nuestra capacidad para estudiar y comprender la Inmunobiología de las células. Mientras que extremadamente es útil para determinar la cantidad y el fenotipo de las células T específicas de antígeno, citometría de flujo no puede determinar la localización espacial de las células a otras células y estructuras de los tejidos y las técnicas actuales de desagregación específica de antígeno para extraer la T las células necesitan para citometría de flujo han limitado eficacia en tejidos no linfoides. In situ Tinción de MHC-tetrámero (IST) es una técnica para visualizar las células T que son específicas para antígenos de interés en los tejidos. En combinación con inmunohistoquímica (IHQ), IST puede determinar la abundancia, la ubicación y el fenotipo de las células CD8 y CD4 T específica de antígeno en los tejidos. Aquí, describimos un protocolo para manchar y para enumerar las células de T CD8 específica de antígeno, con fenotipos específicos ubicados dentro de compartimientos de tejido específico. Estos procedimientos son los mismos que utilizamos en nuestra reciente publicación por Li et al., titulado "las células productoras de Virus Simian de la inmunodeficiencia en los folículos se suprimen parcialmente por CD8 células+ en Vivo." Los métodos descritos son ampliamente aplicables ya que se pueden utilizar para localizar, fenotipo y cuantificar esencialmente cualquier célula T CD8 específica de antígeno para el cual tetrámeros de MHC están disponibles, en cualquier tejido.

La figura 1 muestra cómo recopilar imágenes confocales utilizando un microscopio confocal. Figura 2 muestra el análisis de imagen cuantitativo con ImageJ. Figuras 3 y 4 muestran a representante imágenes de tejidos del nodo de linfa de un SIV infectaron macaque del macaco de manchados de tetrámeros de MHC, CD8 anticuerpos y anticuerpos CD20 y sirven para demostrar la especificidad de la tinci...

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In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Aquí, describimos un método que combina en situ MHC tetramer tinción con inmunohistoquímica para determinar localización, fenotipo y cantidad de antígenos específicos de células T en los tejidos. Este protocolo se utiliza para determinar las características espaciales y fenotípicas de las células de T CD8 específica de antígeno con respecto a otro tipo de célula y las estructuras de los tejidos.

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

12.2K vistas.  University of Minnesota. Aquí, describimos un método que combina en situ MHC tetramer tinción con inmunohistoquímica para determinar localización, fenotipo y cantidad de antígenos específicos de células T en los tejidos. Este protocolo se utiliza para determinar las características espaciales y fenotípicas de las células de T CD8 específica de antígeno con respecto a otro tipo de célula y las estructuras de los tejidos.

Video: In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it is now well established that the immune infiltrate in human tumors can correlate with prognosis and response to therapy. The analysis of the immune infiltrate in the tumor microenvironment has become a major challenge for the classification of patients and the response to treatment.
The co-expression of inhibitory receptors such as Program Cell Death Protein 1 (PD1; also known as CD279), Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Cell Immunoglobulin and Mucin Containing Protein-3 (Tim-3; also known as CD366), and Lymphocyte Activation Gene 3 (Lag-3; also known as CD223), is a hallmark of T cell exhaustion. We developed a multiparametric in situ immunofluorescence staining to identify and quantify at the cellular level the co-expression of these inhibitory receptors. On a retrospective series of frozen tissue of renal cell carcinomas (RCC), using a fluorescence multispectral imaging technology coupled with an image analysis software, it was found that co-expression of PD-1 and Tim-3 on tumor infiltrating CD8+ T cells is correlated with a poor prognosis in RCC. To our knowledge, this represents the first study demonstrating that this automated multiplex in situ technology may have some clinical relevance.

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Studying tumor microenvironment may identify prognostic or predictive biomarkers of clinical response to immunotherapy. Presented here, is an innovative method based on in situ fluorescence multispectral imaging to analyze and count automatically various subpopulations of CD8+ T cells. This reproducible and reliable technique is suitable for large cohort analyses.

Multiplexado de análisis de la inmunofluorescencia y la cuantificación de Intratumoral PD-1+ + de Tim-3 CD8 células+ T

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Inmunología e Infección

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Biología

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica<sup&gt; +</sup&gt; Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Cuantificación simultánea de CD8 anti-vector y Anti-transgénicos-específico+ T células vía MHC Tetramer tinción después de la vacunación con un Vector Viral

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Aislamiento y caracterización de linfocitos T específicos de antígeno en pulmones de ratón

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

Autor destacado: Protocolo optimizado para detectar células T específicas de antígeno en pulmones de ratón utilizando tetrámeros

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

Identificación de células T raras específicas de antígeno de pulmones de ratón con tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico:principal

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

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