Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения гранты от национальных институтов здравоохранения (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. день 1: свежие ткани секционирование и основная инкубация <ol><li>использования скальпеля для свежих ткани нарезать небольшие (около 0,5 см шириной 0,5 см высотой). Отдельно клей каждой ткани на поршень и вставлять их в 3-5 мл 4% температура расплава агарозы в PBS. Ярлык поршень с информацией ткани с помощью наклейки. Положите его в охлажденной держателя в ведёрке со льдом затвердеть.</li>
	<li>Включите микротома и набор, толщина секций 200 µm. установки лезвия бритвы микротома и вставьте поршень монтируется с ткани в ванне микротома.</li>
	<li>Подготовить фосфат амортизированное saline с гепарином (PBS-H), добавив 100 мкг/мл или 18.7 ед/мл гепарина PBS для сохранения РНК и разрешить потенциальные иш приложений вниз по течению. Наполнить ванну микротом, охватывающих встроенных ткани, с 100-120 мл охлажденного, стерильные PBS-H. Добавить кубики льда PBS-H в ванну для поддержания температуры на 0 - 2 ° C. Start микротома и вырезать ткань разделов 200 мкм. 
	Примечание: Важно сохранить ткани, охлаждается на льду для сведения к минимуму клеточную активность в тканях и потому что свежие ткани легче раздел, когда он охлаждается. PBS одиночку может использоваться, если есть нет планов по течению ISH.</li>
	<li>В качестве альтернативы, для тканей, которые не режут с микротом (например, кишечника и легких), использовать скальпелем или лезвием бритвы для нарезать тонкими полосками, как ткани как можно ближе к 200 µm.</li>
	<li>Этикетка крышку 24-ну тканевые культуры пластин с данными экспериментального образца и место ткани камер в соответствующих скважин. Использовать кисть для передачи разделов в ткани камеру набор в хорошо 24-ну культуры ткани пластины, содержащие 1 мл охлажденной PBS-H. 
	Примечание: Многоразовые ткани камеры должны быть сделаны до начала пятнать. Ткани камеры могут быть сделаны с помощью 14 мл полипропиленовые раунд дно оснастки крышка трубки и сетка. Используйте острые лезвия бритвы с обрезают в нижней части 14 мл полипропиленовые раунд дно оснастки Кап трубки. Вырежьте сетка в круг, чтобы поместиться в отверстие в нижней части трубки. Тепла в круг сетки проволока, с помощью горелки Бунзена, до тех пор, пока это докрасна. Очень быстро установить круг сетки проволока вниз и вставьте трубу на сетке. Убедитесь, что сетка надежно прикреплена к нижней части трубки и затем тщательно отрезать в верхней части трубки на отметке 3 мл, используя острые лезвия бритвы. В каждой ткани камеру, или до 1 см 2 ткани в хорошо Положите до 3 разделах ткани. Сохранить по крайней мере один пустой колодец между скважинами с комбинации различных антител, чтобы избежать перекрестного загрязнения.</li>
	Тетрамер <li>приступить к первичной реплике и антитело пятная сразу же после окончания передачи всех отрезока разделов в ткани камеры. Держите разделы погружен и охлажденные в 1 мл PBS-H во все времена.</li>
	<li>Инкубировать разделов ткани на ночь с 0,5 мкг/мл конъюгированных FITC, загрузки пептидной MHC-I тетрамера разводят в PBS-H с 2% нормальной козьего сыворотки (НГС). Мышь или других кролика-антитела, направленные на внеклеточные epitopes интерес в этом инкубации (например, антитела анти CD8 крыса разводят 1: 500 в PBS-H с 2% NGS). Место 1 мл разбавленной антител в каждой скважине. 
	Примечание: Следует при выборе CD8 антител, как некоторые могут повысить и некоторые могут препятствовать MHC-тетрамера к Т-клеточных рецепторов 4 , 21. Крыса античеловеческие CD8 антитела описанных здесь неустойчива и иногда приводит к несколько слабых пятнать. Он используется здесь для тройной маркировки, потому что это только не кролик и антитела CD8-мышь протестированы что CD8 Т-клеток окрашенных резус макака.</li>
	<li>Использовать 1 мл раствора на хорошо для основного антитела и всех последующих инкубаций и выполнять этот и все последующие инкубаций при 4 ° C, с пластинами на качающейся платформе. 
	Примечание: Ткани должны свободно плавать в камере.</li>
</ol> 2. День 2: Фиксация и вторичных инкубации <ol><li>после первичного инкубации, мыть разделы дважды с 1 мл охлажденного PBS-ч 20 мин каждый мыть. Сделать это путем передачи ткани камер различных культуры ткани 24-ну пластины, содержащие 1 мл охлажденной PBS-H в соответствующем скважинах. 
	Примечание: Будьте осторожны, чтобы не капать содержимое из одного экспериментального образца в другую, при перемещении между камерами ткани. Для всех последующих инкубаций и смывки аналогичным образом передать ткани камеры чистого пластину, содержащий соответствующее решение. Убедитесь в том, что контролировать разделов в ткани камерах во время процедуры, чтобы убедиться, что разделы не застревают в стороны ткани палат. Если они подтолкнуть их обратно в решение.</li>
	<li>Исправить разделы с 1 мл свежего PBS-амортизированное параформальдегида 4% для 2 ч при комнатной температуре (не слишком исправить). Мыть холодной PBS-h дважды за 5 мин 
	Предупреждение: Параформальдегида токсичен; носите соответствующие средства индивидуальной защиты. 
	Примечание: Если для выявления внутриклеточных epitopes требуется извлечение антигена и permeabilization, антигены можно извлечь путем кипячения в подразделах 0,01 моль мочевины после фиксации параформальдегида.</li>
	<li>Переноса разделов в 24-ну культуры пластин, содержащий 0,01 моль мочевины и место этих плит в микроволновой печи. Отварить в разделах три раза около 10 s каждого, в общей сложности 30 s. 
	Примечание: Будьте очень осторожны, как кипячение решение может заставить разделы из скважин. Если это произойдет, используйте кисть для отодвинуть разделы из сторон палаты ткани или крышку плиты в нижней части камеры соответствующие ткани.</li>
	<li>Ранее на вторичное антитело инкубации, разрушения и блокировать разделов ткани, инкубации их в блокировки раствор, содержащий PBS-H, 0,3% моющего средства (PBS-H-T) и 2% NGS на рокер за 1 ч при 4 ° C. выполнение последующих антитела инкубаций с PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>Для вторичного инкубации, передачи разделов в ткани камер для скважин, содержащие мэм разбавленный антитела анти FITC кролика в PBS-H-T/2% NGS. Инкубируйте на ночь.</li>
	<li>Выполнять counterstaining с помощью мыши анти CD20 антитело разводят 1: 200 в PBS-H-T/2% NGS. Для этого варианта получения epitopes, если это необходимо, пронизывают клетки и блокировать до инкубации, как описано выше.</li>
</ol> 3. День 3: Третичный инкубации <ol>, <li>после второго инкубации, мыть в разделах три раза в PBS-H на 4 ° C для по крайней мере 20 мин.</li>
	<li>Выполнить окончательное инкубации с соответствующим дневно помечены антител (например, коза анти кролик конъюгированных зеленовато-жёлтый, коза анти крыса конъюгированных далеко красного красителя и коза анти мыши конъюгированных зеленый краситель антитела разбавленных 1:5, 000, 1:5, 000 и 1:2, 000, соответственно, в PBS-H-T/2% NGS). Инкубируйте на ночь. 
	Примечание: на данный момент, инкубации может продлеваться на срок до трех суток при необходимости. Держите разделы, защищенном от света, завернув пластины в жестяной фольги во время этой incuшаг bation и впоследствии, как свет утоляет флуорофоров.</li>
</ol> 4. День 4: Монтаж в разделах <ol><li>мыть секции три раза в PBS-H для по крайней мере 20 мин 
	Примечание: Если планирование течению иш 19, исправить разделы параформальдегида 4% за 1 час для обеспечения тетрамера и антител на месте, а затем вымыть разделы дважды с PBS-Ч 5 мин. 
	Предупреждение: Параформальдегида токсичен; носите соответствующие средства индивидуальной защиты.</li>
	<li>Использовать кисть для передачи в разделах микроскопа. Будьте осторожны, чтобы не толкать ткани слишком много. Покройте каждый раздел с глицерином/желатин содержит галлат н пропиловый 4 мг/мл или другой носитель монтажа, содержащий Флюорофор консерванта. Крышка с coverslip.</li>
	<li>Хранить слайды в контейнере свет защищенные слайд в -20 ° C. промойте пластины культуры ткани и удалить метки на крышки, с помощью спирта. 
	Примечание: Пластины могут быть повторно использованы.</li>
</ol> 5. Приобретение Конфокальный микроскоп изображений <ol><li>захвата изображения с высоким разрешением с конфокального микроскопа, используя соответствующие лазеры и фильтры для каждого Флюорофор ( Рисунок 1A и B). 
	Примечание: В этом примере конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов) был использован. Изображения были собраны с использованием 561 Нм лазер на 20% мощности для зеленовато желтые меченых антиген специфические Т-клетки, 488 нм лазер на 10% мощности для Грин меченых CD20-выражая B клеток и 640 Нм лазер на 15% мощность для далеко красной надписью CD8 Т-клеток. 20 X цель и числовая апертура 0,8 использовались.</li>
	<li>Последовательно собирать z серии на 3 мкм (или других) интервалы на трех каналах в нескольких полях 800 x 800 пикселей. Строительство монтаж собранных поля ( рис. 1 c -E). Имя каждого Фотомонтаж изображения, основываясь на информации соответствующего слайда и сохранить для анализа.</li>
	<li>Выполнять анализ количественных изображений с помощью программного обеспечения анализа и количественной оценки соответствующих Конфокальный микроскоп или ImageJ.</li>
</ol> 6. Количественный анализ изображений Примечание: анализ количественных изображения может быть достигнуто с помощью программного обеспечения анализа и количественной оценки Конфокальный микроскоп или с помощью ImageJ программного обеспечения. Здесь, ImageJ был использован в качестве примера.
<ol><li>Открыть в конфокальных фотомонтаж, перетащив его в ImageJ окно ( рисунок 2A). 
	Примечание: ImageJ можно напрямую открыть фотомонтажи, собранные многих различных конфокальные микроскопы. Если монтаж не может быть открыт непосредственно ImageJ, экспортировать z сканирования как TIFF файл, чтобы открыть его</li>
	<li>Дублировать z сканирования, выбранного для анализа (&#34; изображение &#34;-&#62; &#34; дублировать &#34;) ( рис. 2B).</li>
	<li>Разделить различные каналы (&#34; изображение &#34;-&#62; &#34; цвет &#34;-&#62; &#34; разделить каналы &#34;) ( рис. 2 c).</li>
	<li>Нарисовать ROI для количественного анализа в соответствующем канале быть объективными и добавить его к диспетчеру ROI, нажав &#34; Т &#34; на клавиатуре. Измерить площадь. 
	Примечание: ROI менеджер ImageJ показывает область в мкм 2 ( Рисунок 2D).</li>
	<li>Флуоресценции улучшает яркость и контрастность канала для анализа (&#34; изображение &#34;-&#62; &#34; Настройка &#34;-&#62; &#34; Яркость/контраст &#34;) ( рис. 2е).</li>
	<li>Свести ROI на изображении (&#34; ROI менеджер &#34;-&#62; &#34; Flatten &#34;) ( Рисунок 2F).</li>
	<li>Количественно оценить позитивные клетки в изображения с помощью &#34; многоточечный &#34; инструмент ( рис. 2 g).</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4%28%2B%29+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li>
<li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432944">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HLA-DR%2A08032%2FE7+and+HLA-DR%2A0818%2FE7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4%2B+T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li>
<li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific%2C+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519(2014).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679(2014).</li>
<li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4%2B+T+Cells+in+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).</li>
<li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8%2B+cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li>
<li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0004131">Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).</li>
<li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV%CE%94nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8%2B+T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561(2009).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8%2B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li>
<li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
</ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

IST, в сочетании с IHC обеспечивает важным инструментом для обнаружения, характеризующие и количественного определения антиген специфические CD8 Т-клеток в родной среде других клеток и тканей структур с контекстом. Здесь мы описали подробные процедуры для IST, в сочетании с МГС, следуют анал...

Т-клетки имеют решающее значение для многих иммунологических процессов, включая выявление и устранение инфицированные вирусом клетки, предотвращении аутоиммунные заболевания, оказание помощи в B-клетки и клетки плазмы производства антител и выявления и устранения раковых клеток. Разработка пептида/MHC класса I Тетрамер окрашивание антиген специфические CD8 T клетки1 и более последние разработки MHC класса II Тетрамер окрашивания клеток CD4 T2 подачей cytometry революцию нашу способность учиться и понимать иммунобиологии Т-клеток. Хотя чрезвычайно полезны для определения количества и фенотип антиген специфические Т-клеток, проточной цитометрии не позволяет для обнаружения пространственной локализации антиген специфические Т-клеток в другие клетки и структуры в тканях и текущий дезагрегирования методы для извлечения Т-клетки необходимы для проточной цитометрии ограничивают эффективность в не лимфоидной ткани3.
Мы и другие разработали методы, с помощью загрузки пептидной MHC класса I и класса II Тетрамер или multimer реагенты пятно антиген специфические CD4 T и CD8 клетки в тканях4,5,,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Эти IST методы позволяют для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 и CD4 T клеток в тканях и обеспечивать средства для выявления этих клеток относительно других ячеек и структур в тканях. Наша группа широко использовала MHC-I Тетрамер окрашивания для изучения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) - и обезьяний иммунодефицита (СИВ) - конкретных CD8 Т-клеток лимфоидной, половых органов и ректальной тканей, чтобы получить представление о ВИЧ и Сив иммунопатогенезе и выявления корреляты успешной вакцинации стратегии14,,1516,17. Кроме того мы также разработал метод, который сочетает в себе IST в situ гибридизация (ISH) для локализации и количественно вирус специфических Т CD8 клетки и клетки, инфицированные вирусом, в тканях и определить в vivo эффекторных до целевых уровней 18 , 19.
Здесь мы описываем протокол, с помощью загрузки пептидной MHC-I тетрамера пятно антиген специфические CD8 Т-клеток в разделах свежие ткани, чтобы изображение тканей с помощью IHC и дать количественную оценку клетки с конкретными фенотипы в отсеках конкретных тканей. Эти процедуры являются так же, как были использованы в нашей недавней публикации Li et al., в котором мы определили местонахождение, изобилия и фенотип SIV-специфических Т-клеток в лимфоидной ткани во время хронической инфекции SIV в макак20.
Для выполнения этой процедуры, свежие ткани секционного и инкубированы всю ночь с загрузки пептидной MHC-I тетрамера конъюгированных флуоресцеин тиоцианат молекулы (FITC). Затем они фиксируются в параформальдегида. После фиксации ткани, сигнал от тетрамера MHC усиливается с использованием антител анти FITC кролика и инкубировали с дневно меткой анти кролик IgG антитела, которые далее усилить сигнал от связанного тетрамера. IHC используется в сочетании с IST характеризовать антиген специфические Т-клеток и окружающие клетки. Антитела, которые признают epitopes на поверхности клеток или внеклеточного пространства, включены в основной инкубации с тетрамера. Антитела, которые признают внутриклеточных epitopes требуют пропитывание клеточной стенки до окрашивания. В разделах окрашенных тканей отражаются с помощью конфокального микроскопа и проанализированы с помощью конфокальной программного обеспечения. Приклеенные этикетку клетки являются количественно с помощью конфокальной микроскопии программного обеспечения или ImageJ. Описывается протокол может использоваться для пятна практически любой антиген специфические CD8 Т-клеток в любой ткани для которых MHC-I тетрамера доступны.

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBL6391V</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Razor&amp;nbsp; blade</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather Disposable Scalpel</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Round paintbrush #2</td><td>PRINCETON ART &amp;amp; BRUSH CO.</td><td>4350R</td><td>Can trim as needed with razor</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

Т-клетки имеют решающее значение для многих иммунологических процессов, включая выявление и устранение инфицированные вирусом клетки, предотвращении аутоиммунные заболевания, оказание помощи в B-клетки и клетки плазмы производства антител и выявления и устранения раковых клеток. Разработка MHC-Тетрамер пятнать антиген специфические Т-клеток проанализирована подачей cytometry революционизировало нашу способность учиться и понимать иммунобиологии Т-клеток. Хотя чрезвычайно полезны для определения количества и фенотип антиген специфические Т-клеток, проточной цитометрии невозможно определить пространственной локализации антиген специфические Т-клеток в другие клетки и структуры в тканях и текущие методы дезагрегирования чтобы извлечь T клетки необходимы для проточной цитометрии ограничивают эффективность в не лимфоидной ткани. На месте MHC-Тетрамер окрашивание (IST) — это метод для визуализации Т-клеток, которые являются специфическими для антигенов интерес в тканях. В сочетании с иммуногистохимия (IHC) IST можно определить изобилие, местоположение и фенотип антиген специфические CD8 и CD4 T клеток в тканях. Здесь мы описываем протокол к пятно и перечислить антиген специфические CD8 Т-клеток, с конкретными фенотипов, расположенных в пределах конкретных тканей отсеков. Эти процедуры являются те же, что мы использовали в нашей недавней публикации Li et al., под названием «Обезьяний вирус иммунодефицита-продуцирующие клетки в фолликулах частично подавлен CD8 клетки+ In Vivo.» Описанные методы широко применяются, потому что они могут использоваться для локализации, фенотип и количественно практически любой антиген специфические CD8 Т-клеток для которой доступны MHC-тетрамера, в любой ткани.

Рисунок 1 показывает как собирать конфокальный изображения с помощью конфокального микроскопа. Рисунок 2 демонстрирует анализ количественных изображений с помощью ImageJ. Рисунки 3 и 4 Показать представитель изображени?...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues at JoVE

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Здесь мы описываем метод, который сочетает в себе в situ MHC-Тетрамер пятнать иммуногистохимия для определения локализации, фенотип и количество антиген специфические Т-клеток в тканях. Этот протокол используется для определения пространственных и фенотипические характеристики антиген специфические CD8 Т-клеток по отношению к другой тип клеток и структуры в тканях.

На месте MHC-Тетрамер окрашивание и количественный анализ для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

12.2K Views.  University of Minnesota. Здесь мы описываем метод, который сочетает в себе в situ MHC-Тетрамер пятнать иммуногистохимия для определения локализации, фенотип и количество антиген специфические Т-клеток в тканях. Этот протокол используется для определения пространственных и фенотип...

Video: In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it is now well established that the immune infiltrate in human tumors can correlate with prognosis and response to therapy. The analysis of the immune infiltrate in the tumor microenvironment has become a major challenge for the classification of patients and the response to treatment.
The co-expression of inhibitory receptors such as Program Cell Death Protein 1 (PD1; also known as CD279), Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Cell Immunoglobulin and Mucin Containing Protein-3 (Tim-3; also known as CD366), and Lymphocyte Activation Gene 3 (Lag-3; also known as CD223), is a hallmark of T cell exhaustion. We developed a multiparametric in situ immunofluorescence staining to identify and quantify at the cellular level the co-expression of these inhibitory receptors. On a retrospective series of frozen tissue of renal cell carcinomas (RCC), using a fluorescence multispectral imaging technology coupled with an image analysis software, it was found that co-expression of PD-1 and Tim-3 on tumor infiltrating CD8+ T cells is correlated with a poor prognosis in RCC. To our knowledge, this represents the first study demonstrating that this automated multiplex in situ technology may have some clinical relevance.

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Studying tumor microenvironment may identify prognostic or predictive biomarkers of clinical response to immunotherapy. Presented here, is an innovative method based on in situ fluorescence multispectral imaging to analyze and count automatically various subpopulations of CD8+ T cells. This reproducible and reliable technique is suitable for large cohort analyses.

Мультиплексированных помощью иммунофлуоресцентного анализа и количественной оценки внутриопухолевых PD-1+ Тим-3+ CD8 клетки+ T

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Cancer Research

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Пептиды: MHC тетрамеров на основе обогащения эпитопов Т-клеток

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Визуализация антиген Конкретные CD4 + Т-клеток с использованием МНС класс II тетрамеров

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Biology

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

Трансплантация опухоли для оценки динамики инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток у мышей

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

В Ситу обнаружения Аутореактивных CD4 Т-клеток в мозг и сердце Использование главного комплекса гистосовместимости Dextramers комплекс класса II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Техника одновременно визуализировать вирус-специфических CD8 + T-клетки и инфицированные вирусом клетки В месте</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8<sup&gt; +</sup&gt; Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Одновременная количественная оценка анти вектор и анти трансген конкретных CD8+ T клетки через MHC Тетрамер пятная после вакцинации с вирусный вектор

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Выделение и характеристика антиген-специфических Т-клеток в легких мышей

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

В центре внимания автора: Оптимизированный протокол обнаружения антиген-специфических Т-клеток в легких мышей с помощью тетрамеров

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

Идентификация редких антиген-специфических Т-клеток из легких мышей с помощью пептид:Тетрамеры основного комплекса гистосовместимости

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

На месте MHC-Тетрамер окрашивание и количественный анализ для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST