Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública concede a partir do National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. dia 1: corte de tecido fresco e incubação primário <ol><li>uso um bisturi para cortar o tecido fresco em pedaços pequenos (aproximadamente 0,5 cm de largura por 0,5 cm de altura). Separadamente cada tecido para um êmbolo de cola e incorporá-los com 3-5 mL de agarose de baixo ponto de fusão de 4% em PBS. Rotule o êmbolo com a informação do tecido usando um adesivo. Colocá-lo em um suporte refrigerado em um balde de gelo para solidificar o.</li>
	<li>Ativar o micrótomo e defina a espessura das seções a 200 µm. Instale uma lâmina de barbear o micrótomo e insira o êmbolo montada com tecido no banho de micrótomo.</li>
	<li>Preparar o tampão fosfato salino com heparina (PBS-H) adicionando-se 100 µ g/mL ou 18,7 U/mL heparina para PBS para preservar o RNA e para permitir que aplicações potenciais ISH a jusante. Encher a banheira do micrótomo, cobrindo o tecido incorporado, com 100-120 mL de PBS estéril, refrigerado-H. Adicione cubos de gelo de PBS-H para o banho para manter a temperatura em 0 - 2 ° C. Start o micrótomo e corte o tecido em 200 µm seções. 
	Nota: É importante manter os tecidos refrigerados no gelo para minimizar a atividade celular nos tecidos e porque o tecido fresco é mais fácil de seção quando é tranquilo. PBS sozinho pode ser usado se não existem planos para jusante ISH.</li>
	<li>Como alternativa, para tecidos que não cortadas com um micrótomo (por exemplo, intestino e pulmão), usar um bisturi ou lâmina de barbear para cortar o tecido em tiras finas como perto possível a 200 µm.</li>
	<li>Rotular a tampa das placas de cultura de tecidos de 24-bem com a informação da amostra experimental e colocar as câmaras de tecido em poços correspondentes. Use um pincel para transferir as seções para uma câmara de tecido conjunto no poço de uma placa de cultura de tecidos de 24-poço contendo 1 mL de refrigerados PBS-H. 
	Nota: As câmaras de tecido reutilizável devem ser feitas antes de iniciar a coloração. Câmaras de tecido podem ser feitas usando um tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fundo redondo e engranzamento de fio. Use uma lâmina afiada para cortar a parte inferior de um tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fundo redondo. Corte a malha de arame em um círculo para caber o buraco no fundo do tubo. O círculo de malha de arame usando um bico de Bunsen, até ficar em brasa de calor. Definir o círculo de malha de arame para baixo muito rapidamente e empurre o tubo para dentro da malha. Verifique se o engranzamento de fio é firmemente ligado ao fundo do tubo e então cuidadosamente cortar o topo do tubo na marca de 3 mL, usando uma lâmina de barbear afiada. Coloque até 3 seções de tecido em cada câmara de tecido, ou até 1 cm 2 de tecido por bem. Manter pelo menos um poço vazio entre poços com combinações de anticorpos diferentes para evitar a contaminação cruzada.</li>
	<li>Proceder ao primário tetrâmero e anticorpo que mancha imediatamente depois de terminar a transferência de todas as seções cortadas em câmaras de tecidos. Manter as seções submerso e refrigeradas em 1 mL de PBS-H em todos os momentos.</li>
	<li>Incubar as seções de tecido durante a noite com 0,5 µ g/mL de conjugado FITC, peptídeo-carregado MHC-eu tetrâmeros diluídos em PBS-H, com 2% de soro de cabra normal (NGS). Incluir o mouse ou outros anticorpos de coelho não dirigidos a epitopos extracelulares de interesse nesta incubação (por exemplo, os anticorpos de anti-CD8 rato diluída a 1: 500 em PBS-H, com 2% NGS). Coloque 1 mL de anticorpos diluídos em cada poço. 
	Nota: Tenha cuidado ao selecionar o CD8 anticorpos, como alguns podem realçar e alguns podem inibir tetrâmeros MHC ligação a receptores de células T 4 , 21. O anticorpo de CD8 anti-humano rato descrito aqui é instável e às vezes resulta em coloração um pouco fraco. Ele é usado aqui para etiquetar triplo, porque é o único não-coelho e anticorpos de CD8 sem mouse testaram que as células T CD8 de macaco reso manchada.</li>
	<li>Use 1 mL de solução por alvéolo para o anticorpo primário e incubação do subsequentes todas as e realizar isso e todos incubação do subsequente a 4 ° C, com as placas em uma plataforma oscilante. 
	Nota: Os tecidos devem flutuar livremente na câmara.</li>
</ol> 2. Dia 2: Fixação e incubação secundário <ol><li>após a incubação primária, lavar as seções duas vezes com 1 mL de PBS-H refrigerado por 20 min a cada lavagem. Para fazer isso, transferindo as câmaras de tecido para uma placa de cultura de tecido de 24-bem diferente contendo 1 mL de PBS-H refrigerado em poços correspondentes. 
	Nota: Tenha cuidado para não pingar o conteúdo de uma amostra experimental em outro quando se deslocam entre as câmaras de tecido. Para todos os subsequentes incubação do e lavagens, da mesma forma transferi a câmara de tecido para um prato limpo, contendo a solução adequada. Certifique-se de monitorar as seções nas câmaras de tecido durante o procedimento para certificar-se de que as seções não ficar preso aos lados das câmaras de tecido. Se eles, empurrá-los de volta para a solução.</li>
	<li>Corrigir as seções com 1 mL de fresco tampão PBS paraformaldeído 4% para 2 h à temperatura ambiente (não excessivamente corrigir). Lavagem com PBS-H frio duas vezes por 5 min. 
	Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar equipamento de protecção adequado. 
	Nota: Se a recuperação do antígeno e permeabilização é necessária para detectar intracellular epitopes, antígenos podem ser recuperados por ebulição as seções em ureia de mol 0,01 após a fixação do paraformaldehyde.</li>
	<li>Transferir as seções em placas de cultura 24-poço contendo ureia de mol 0,01 e colocar estas placas em um forno de microondas. Ferva as seções três vezes por cerca de 10 s cada um, para um total de 30 s. 
	Nota: Tenha muito cuidado, como ferver a solução pode forçar as seções fora dos poços. Se isso acontecer, use um pincel de adiar as seções das paredes da câmara de tecido ou da tampa da placa na parte inferior da câmara de tecido apropriado.</li>
	<li>Prévio para a incubação do anticorpo secundário, permeabilize e bloquear as secções de tecido incubando-os em solução de bloqueio contendo PBS-H, 0,3% de detergente (PBS-H-T) e 2% NGS sobre um roqueiro para 1 h a 4 ° C. Perform subsequente incubação do anticorpo com NGS PBS-H-T/2%.</li>
	<li>Para a incubação secundária, transferir as seções nas câmaras de tecido para poços contendo coelho anti-FITC 1:10,000 de anticorpo diluído em NGS PBS-H-T/2%. Incubar durante uma noite.</li>
	<li>Perform counterstaining usando anticorpo anti-CD20 de rato diluído 1: 200 em PBS-H-T/2% NGS. Para essa opção, recuperar os epítopos, se necessário, permeiam as células e bloquear antes esta incubação, conforme descrito acima.</li>
</ol> 3. Dia 3: Incubação terciária <ol><li>após a segunda incubação, lavar as seções três vezes em PBS-H a 4 ° C, durante pelo menos 20 min.</li>
	<li>Realizar uma incubação final com o apropriado fluorescente etiquetado anticorpos (por exemplo, de cabra anticoelho conjugado amarelo esverdeado, cabra anti-rato conjugados tintura muito vermelha e cabra anti-rato tintura verde conjugado anticorpos diluído 1:5, 000, 1:5, 000 e 1:2, 000, respectivamente, em PBS-H-T/2% NGS). Incubar durante uma noite. 
	Nota: neste ponto, a incubação pode ser estendida por até três dias se necessário. Manter as seções protegidas da luz envolvendo as placas em folha de estanho durante este incupasso bation e, posteriormente, como luz sacia fluorophores.</li>
</ol> 4. Dia 4: As seções de montagem <ol><li>lavar as seções três vezes em PBS-H pelo menos 20 min. 
	Nota: Se o planejamento para a jusante ISH 19, corrigir as seções em paraformaldeído 4% para 1 h para garantir os tetrâmeros e anticorpos no lugar e depois lavar as seções duas vezes com PBS-H por 5 min cada. 
	Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar equipamento de protecção adequado.</li>
	<li>Usar um pincel para transferir as seções para uma lâmina de microscópio. Tenha cuidado para não cutucar o tecido demais. Cubra cada seção com glicerol/gelatina contendo 4 mg/mL de n-propil galato ou outro meio de montagem, contendo um fluoróforo conservante. Cobrir com uma lamela.</li>
	<li>Armazenar os slides em um recipiente protegido contra luz slide em -20 ° C. Lave as placas de cultura de tecidos e remover os rótulos nas tampas usando álcool. 
	Nota: As placas podem ser reutilizadas..</li>
</ol> 5. Aquisição de imagens de microscópio Confocal <ol><li>captura imagens de alta resolução com um microscópio confocal, usando o apropriado lasers e filtros para cada fluoróforo ( figura 1A e B). 
	Nota: Neste exemplo, um microscópio confocal (consulte a Tabela de materiais) foi usado. Imagens foram coletadas usando o 561 nm laser em 20% de energia para as células de T de antígeno-específicas rótulo amarelo esverdeadas, o laser de 488 nm em potência de 10% para as células B CD20-expressando de rótulo verde e 640 nm laser em 15% de energia para as células T CD8 de longe com rótulo vermelho. Utilizaram-se os 20 X objetivo e uma abertura numérica de 0,8.</li>
	<li>Sequencialmente coletar intervalos de z-série em 3 µm (ou outro) em três canais em vários campos de 800 x 800 pixels. Construir uma montagem dos campos coletados ( Figura 1 -E). Nomeie cada imagem de montagem com base nas informações do slide correspondente e salvar para análise.</li>
	<li>Realizar a análise quantitativa de imagem usando o software de análise e quantificação do respectivo microscópio confocal ou ImageJ.</li>
</ol> 6. Análise quantitativa de imagem Nota: análise quantitativa de imagem pode ser realizado usando software de análise e quantificação do microscópio confocal ou usando o software ImageJ. Aqui, o ImageJ foi usado como exemplo.
Montagem de <ol><li>aberto por confocal arrastando-o para a janela do ImageJ ( Figura 2A). 
	Nota: ImageJ pode abrir diretamente montagens coletadas por muitos diferentes microscópios confocal. Se a montagem não pode ser aberta diretamente pelo ImageJ, exportar o z-scan selecionado como um arquivo TIFF para abri-la</li>
	<li>Duplicar o z-scan selecionado para análise (&#34; imagem &#34;-&#62; &#34; duplicar &#34;) ( Figura 2B).</li>
	<li>Dividir os diferentes canais (&#34; imagem &#34;-&#62; &#34; cor &#34;-&#62; &#34; Split canais &#34;) ( Figura 2).</li>
	<li>Desenhar o ROI da análise quantitativa no canal correspondente para ser objectivo e adicioná-lo ao gerente do ROI pressionando &#34; T &#34; no teclado. Medir a área de. 
	Nota: O Gerenciador de ROI do ImageJ mostra a área em µm 2 ( Figura 2D).</li>
	<li>Ajustar o brilho da fluorescência e contraste do canal a ser analisado (&#34; imagem &#34;-&#62; &#34; ajuste &#34;-&#62; &#34; brilho/contraste &#34;) ( Figura 2E).</li>
	<li>Achatar o ROI na imagem (&#34; Gerenciador de ROI &#34;-&#62; &#34; Flatten &#34;) ( Figura 2F).</li>
	<li>Quantificar as células positivas a imagem usando o &#34; multi-ponto &#34; ferramenta ( Figura 2).</li>
</ol>

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Os autores não têm nada para divulgar.

IST combinada com IHC fornece uma ferramenta essencial para detectar, caracterizar e quantificar as células T CD8 de antígeno-específicas em ambientes nativos com o contexto de outras células e estruturas do tecido. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para IST combinada com IHC, seguido de análise quantitativa de imagem, para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 de antígeno-específicas em linfonodos de macacos rhesus. Coloração semelhante pode ser aplicada ao ser humano...

As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento de peptídeo/MHC classe I tetrâmero coloração de antígeno-específicas1 as células T CD8 e o mais recente desenvolvimento de MHC classe II tetrâmero coloração de células T CD42 por citometria de fluxo revolucionou a nossa capacidade de estudar e compreender o Immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não permitir a detecção da localização espacial das pilhas de T antígeno-específicas para outras células e estruturas nos tecidos e atual técnicas de desagregação para extrair as células T necessários por citometria de fluxo tem limitada eficácia em tecidos não-linfoides3.
Nós e os outros têm desenvolvido métodos usando peptídeo carregado MHC-classe I e classe tetrâmero II ou multimer reagentes para manchar as células CD8 e CD4 T antígeno-específicas em tecidos4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST estes métodos permitem a determinação do local, abundância e fenótipo de células CD8 e CD4 T antígeno-específicos tecidos e fornecer um meio para detectar dessas células em relação a outras estruturas nos tecidos e células. Nosso grupo tem usado extensivamente MHC-eu tetrâmero coloração para estudar o vírus de imunodeficiência humana (HIV) - e o vírus da imunodeficiência símia (SIV) - células T CD8 específicas nos tecidos linfoides, genitais e retais para obter uma compreensão do HIV e SIV imunopatogênese e para identificar correlações de vacinação bem sucedida estratégias14,15,16,17. Além disso, também desenvolvemos uma técnica que combina o IST com hibridação in situ (ISH) para localizar e quantificar as células T CD8 de vírus específicos e células infectadas por vírus em tecidos e para determinar os níveis de efetor-alvo na vivo 18 , 19.
Aqui, descrevemos um protocolo utilizando peptídeo carregado MHC-eu tetrâmeros manchar as células T CD8 de antígeno-específicas em secções de tecido fresco, para tecidos de corante de contraste usando IHC e quantificar células com fenótipos específicos em compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são os mesmos que foram utilizados em nossa recente publicação por Li et al, em que determinamos a localização, abundância e fenótipo de células T específicas SIV em tecido linfoide durante a infecção crônica do SIV em macacos20.
Para este procedimento, tecidos frescos são seccionados e incubados durante a noite com MHC do peptide-carregado-eu tetrâmeros conjugados a moléculas de tiocianato de fluoresceína (FITC). Então, eles são fixos em paraformaldeído. Após a fixação do tecido, o sinal de tetrâmeros o MHC é amplificado usando anticorpos de coelho anti-FITC e incubadas com fluorescente etiquetados anticorpos IgG anticoelho que mais amplificam o sinal dos limite tetrâmeros. IHC é usado em conjunto com o IST para caracterizar as células T antígeno-específicas e células circundantes. Anticorpos que reconhecem epitopos na superfície das células ou no espaço extracelular são incluídos na incubação preliminar com os tetrâmeros. Anticorpos que reconhecem epítopos intracelulares exigem permeação da parede celular antes da coloração. As secções de tecido manchado são fotografadas usando um microscópio confocal e analisaram utilizando o software confocal. Pilhas etiquetadas são quantificadas utilizando microscopia confocal software ou ImageJ. O protocolo descrito pode ser usado para manchar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicas em qualquer tecido para qual MHC-eu tetrâmeros estão disponíveis.

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBL6391V</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Razor&amp;nbsp; blade</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather Disposable Scalpel</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Round paintbrush #2</td><td>PRINCETON ART &amp;amp; BRUSH CO.</td><td>4350R</td><td>Can trim as needed with razor</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento do MHC-tetrâmero de coloração de células T antígeno-específicas, analisadas por citometria de fluxo tem revolucionado a nossa capacidade de estudar e compreender o immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não é possível determinar a localização espacial de pilhas de T antígeno-específicas de outras células e estruturas em tecidos e técnicas atuais de desagregação para extrair o T células necessárias para citometria de fluxo têm limitado eficácia em tecidos não-linfoides. In situ MHC-tetrâmero coloração (IST) é uma técnica para visualizar as células T que são específicas para os antígenos de interesse em tecidos. Em combinação com imuno-histoquímica (IHC), IST pode determinar a abundância, localização e fenótipo das células CD8 e CD4 T de antígeno-específicas em tecidos. Aqui, descrevemos um protocolo para manchar e enumerar as células T CD8 de antígeno-específicas, com fenótipos específicos localizados dentro de compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são as mesmas que usamos em nossa recente publicação por Li et al, intitulado "células produtoras de Simian vírus da imunodeficiência em folículos são parcialmente suprimidos pelo CD8 células+ In Vivo." Os métodos descritos são amplamente aplicáveis, porque pode ser usados para localizar, fenótipo e quantificar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicos para os quais tetrâmeros MHC estão disponíveis, em qualquer tecido.

A Figura 1 mostra como coletar imagens confocal, usando um microscópio confocal. A Figura 2 demonstra a análise quantitativa de imagem usando o ImageJ. Figuras 3 e 4 mostram representante imagens dos tecidos do nó de linfa de uma SIV infectado macaque do rhesus manchado com tetrâmeros de MHC e CD8 anticorpos anticorpos CD20 e servem para demonstrar a especificidade da MHC-tetrâmero de colora...

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In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Aqui, descrevemos um método que combina em situ MHC-tetrâmero coloração com imuno-histoquímica para determinar a localização, fenótipo e a quantidade de pilhas de T antígeno-específicos nos tecidos. Este protocolo é usado para determinar as características espaciais e fenotípicas de células T CD8 de antígeno-específicas em relação a outro tipo de célula e estruturas nos tecidos.

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

12.2K visualizações.  University of Minnesota. Aqui, descrevemos um método que combina em situ MHC-tetrâmero coloração com imuno-histoquímica para determinar a localização, fenótipo e a quantidade de pilhas de T antígeno-específicos nos tecidos. Este protocolo é usado para determinar as características espaciais e fenotípicas de células T CD8 de antígeno-específicas em relação a outro tipo de célula e estruturas nos tecidos.

Vídeo: In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it is now well established that the immune infiltrate in human tumors can correlate with prognosis and response to therapy. The analysis of the immune infiltrate in the tumor microenvironment has become a major challenge for the classification of patients and the response to treatment.
The co-expression of inhibitory receptors such as Program Cell Death Protein 1 (PD1; also known as CD279), Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Cell Immunoglobulin and Mucin Containing Protein-3 (Tim-3; also known as CD366), and Lymphocyte Activation Gene 3 (Lag-3; also known as CD223), is a hallmark of T cell exhaustion. We developed a multiparametric in situ immunofluorescence staining to identify and quantify at the cellular level the co-expression of these inhibitory receptors. On a retrospective series of frozen tissue of renal cell carcinomas (RCC), using a fluorescence multispectral imaging technology coupled with an image analysis software, it was found that co-expression of PD-1 and Tim-3 on tumor infiltrating CD8+ T cells is correlated with a poor prognosis in RCC. To our knowledge, this represents the first study demonstrating that this automated multiplex in situ technology may have some clinical relevance.

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Studying tumor microenvironment may identify prognostic or predictive biomarkers of clinical response to immunotherapy. Presented here, is an innovative method based on in situ fluorescence multispectral imaging to analyze and count automatically various subpopulations of CD8+ T cells. This reproducible and reliable technique is suitable for large cohort analyses.

Multiplexado imunofluorescência análise e quantificação de Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T células

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Pesquisa do câncer

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Imunologia e Infecção

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Biologia

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

Transplante de tumor para avaliar a dinâmica das células CD8+ T que se infiltram em tumores em camundongos

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia<sup&gt; +</sup&gt; Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Quantificação simultânea de vetor anti e Antiespecíficas do transgene CD8+ T células Via MHC tetrâmero coloração após a vacinação com um vetor Viral

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Isolamento e caracterização de células T antígeno-específicas em pulmões de camundongos

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

Autor em destaque: Protocolo otimizado para detecção de células T específicas de antígeno em pulmões de camundongos usando tetrâmeros

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

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