이 작품에 의해 지원 되었다 공중 보건 서비스는 건강의 국가 학회 (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617)에서 부여.

1. 주 1: 신선한 조직 단면 및 기본 보육 <ol><li>메스를 사용 하 여 신선한 조직 (약 0.5 c m 폭 0.5 c m 키 큰) 작은 조각으로 잘라. 별도로 플런저를 각 조직 접착제 그리고 PBS에 4% 낮은 용융 agarose의 3-5 mL를 포함. 스티커를 사용 하 여 조직 정보와 플런저를 레이블을 지정 합니다. 공고히 하는 얼음 양동이에 냉장된 홀더에 넣어요.</li>
	<li>톰 및 설정 섹션을 200 µ m. 설치 톰 삽입 플런저에 면도날의 두께 톰 목욕에 조직으로 탑재.</li>
	<li>100 µ g/mL 또는 18.7 U/mL 헤 파 린 PBS RNA를 보존 하 고 하류 잠재적인 틱 응용 프로그램 허용에 추가 하 여 헤 파 린 (PBS-H)에 식 염 수 인산 염 버퍼를 준비 합니다. 덮고 냉장, 무 균 PBS.의 100-120 mL와 함께 포함 된 조직, 톰 목욕을 채우기 0-에 온도 유지 하기 위해 목욕을 PBS-H 아이스 큐브를 추가 2 ° C. 시작은 톰와 200 µ m 섹션으로 조직. 
	참고: 그것은 조직에서 조직 내의 세포 활동을 최소화 하기 위해 얼음에 냉장을 유지 하는 것이 중요 때 냉장은 신선한 조직 섹션에 쉽게 때문에 고. 다운스트림 흉내만 대 한 계획이 없습니다 경우 혼자 PBS를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>또는 조직 (예: 창 및 폐), 톰으로 잘 잘라 하지 않는 조직으로 얇은 스트립으로 잘라 메스 또는 면도칼을 사용 200 µ m에 최대한 가까이.</li>
	<li>실험 샘플 정보 24-잘 조직 배양 접시의 뚜껑을 분류 하 고 해당 우물에서 조직 실 장소. 조직 약 실에는 섹션을 전송 하는 붓의 1 mL를 포함 하는 24-잘 조직 배양 접시의 우물에 설정 사용 냉장 PBS. 
	참고: 재사용 가능한 조직 챔버는 얼룩 시작 전에 여야 한다. 조직 실 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 스냅 캡 튜브를 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 와이어 메쉬. 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 스냅 캡 튜브의 바닥을 잘라. 튜브의 아래쪽에 있는 구멍에 맞게 원형에서 철 망을 잘라. 열 새 빨갛게 될 때까지 분 젠 버너를 사용 하 여 와이어 메쉬 원. 매우 신속 하 게 와이어 메쉬 원 뜨 고 메쉬에 튜브를 밀어. 와이어 메쉬는 튜브의 하단에 단단히 부착 하 고 다음에 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 3 mL 마크 튜브의 상단을 신중 하 게 차단 확인 하십시오. 각 조직 챔버, 또는 잘 당 조직의 1 c m 2까지 3 조직 단면도 넣어. 교차 오염을 피하기 위해 서로 다른 항 체 조합 우물 사이의 하나 이상의 빈 잘 유지.</li>
	<li>진행 기본 tetramer와 항 체 조직 챔버로 모든 컷된 섹션의 전송 완료 후 즉시 얼룩. 섹션 빠져들, PBS-H의 1 mL에 항상 냉장 보관.</li>
	<li>0.5 µ g/mL FITC 활용, 펩 티 드 로드 MHC와 하룻밤 조직 단면도 품 어-난 tetramers 2% 정상 염소 혈 청 (NGS) PBS-H에 희석. 마우스 또는 다른 비 토끼 항 체가이 외피의 extracellular epitopes에 포함 (예: 쥐 안티 CD8 항 체 희석 2%와 PBS-h에서 1: 500 NGS). 각 잘에서 희석된 항 체의 1 mL를 배치. 
	참고: 한다 주의 일부 향상 및 일부 MHC tetramers T 세포 수용 체 4 , 21을 억제할 수 있는으로 CD8 항 체를 선택할 때. 쥐 안티 인간 CD8 항 체 여기에 설명 된 불안정 하 고 때로는 다소 약한 얼룩에 결과. 여기에 트리플 라벨 때문에 유일한 비 토끼와 비 마우스 CD8 항 체 테스트 그 얼룩진된 붉은 털 원숭이 CD8 T 세포에 대 한 사용 됩니다.</li>
	<li>잘 당 솔루션의 1 mL를 사용 하 여 1 차적인 항 체 및 모든 후속 외피와 수행이 락 플랫폼에 접시와 4 ° C에서 모든 후속 외피. 
	참고: 조직 해야 플 로트 자유롭게 챔버에.</li>
</ol> 2. 주 2: 고정 및 보조 보육 <ol><li>기본 부 화 후 씻어 냉장된 PBS-H 20 분의 1 mL로 두 번 섹션 각 세척. 조직 실 냉장된 PBS-H 해당 우물의 1 mL를 포함 하는 다른 24-잘 조직 문화 접시에 전송 하 여이 작업을 수행. 
	참고: 수 조직 챔버 사이 이동할 때 다른 한 실험 샘플에서 내용을 똑 하지 않도록 주의 하십시오. 모든 후속 외피와 세척, 마찬가지로 적절 한 솔루션을 포함 하는 깨끗 한 접시에 조직 챔버를 전송 합니다. 조직 실에 섹션에서 섹션 조직 챔버의 측면에 붙어 얻을 할 다는 것을 확인 하는 절차 동안 모니터링 해야 합니다. 그들은 솔루션에 다시 그들을 밀어, 경우.</li>
	<li>신선한 PBS 버퍼링 4 %paraformaldehyde 실 온에서 2 h의 1 mL와 섹션 수정 (않는 이상 해결 되지). 차가운 PBS-h 5 분에 두 번 세척 
	주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용. 
	참고: 항 원 복구 및 permeabilization 세포내 epitopes를 감지 해야, 항 검색할 수 있습니다 paraformaldehyde 고정 후 0.01 mol 요소에 섹션을 끓는.</li>
	<li>0.01 mol 요소를 포함 하는 24-잘 배양 배지로 섹션을 전송 하 고 렌지에이 접시를 놓습니다. 3 번 약 10 대 한 섹션을 삶아 s 30의 총 각, s. 
	참고: 매우 조심, 비등으로 솔루션 우물에서 섹션을 강제로 수 있습니다. 이 경우를 사용 하 여 그림 붓 섹션 조직 챔버의 측면에서 또는 접시의 뚜껑에서 다시 적절 한 조직 챔버의 바닥에.</li>
	<li>이전 이차 항 체 외피를 permeabilize 및 PBS-H, 0.3% 세제 (PBS-H-T), 그리고 2% 차단 솔루션에 그들을 배양 하 여 조직 단면도 차단 1 h와 4 ° C. 수행 후속 항 체 외피에 대 한 로커에 NGS PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>보조 부 화에 대 한 전송 조직 실에서 섹션 PBS-H-T/2% NGS에 토끼 안티 FITC 항 체 희석 1:10,000를 포함 하는 우물. 밤새 품 어.</li>
	<li>수행 counterstaining 사용 하 여 마우스 안티-CD20 항 체 희석 PBS-H-T/2% NGS에서 1: 200. 이 옵션에 대 한 검색에서 epitopes 필요한 경우, 셀, 침투 및 위에서 설명한 대로이 부 화 하기 전에 차단.</li>
</ol> 3. 제 3 일: 3 차 인큐베이션 <ol><li>두 번째 부 화 후 20 분 이상 4 ° C에서 PBS-H에 세 번 섹션을 씻어</li>
	<li>붙일 표시 (예, 염소 안티 토끼 활용 된 염소 반대로 쥐 활용된까지 붉은 염료, 녹색 노란색과 염소 반대로 마우스 활용된 녹색 염료 항 체 희석된 1:5, 000, 항 체와 적절 한 최종 부 화 수행 1:5, 000, 그리고 1:2, 000, PBS-H-T/2% NGS에 각각,). 밤새 품 어. 
	참고:이 시점에서,는 인큐베이션 확장할 수 있습니다 최대 3 일 동안 필요한 경우. 섹션을이 incu 동안 판 틴 호 일에 감싸서 빛 으로부터 보호 유지bation 단계 이후, 빛 냉각 fluorophores.</li>
</ol> 4. 제 4 일: 장착 섹션 <ol><li>세척 섹션 3 회 PBS-H에 20 분 이상 
	참고: 다운스트림 분 19에 대 한 계획, tetramers 및 장소에서 항 체를 확보 하 고 다음 두 번으로 PBS-5 분에 대 한 섹션을 씻어 1 시간에 대 한 4 %paraformaldehyde 섹션 수정. 
	주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용.</li>
	<li>는 현미경 슬라이드를 섹션을 전송 하는 붓을 사용 합니다. 조직을 너무 많이 찌 르 지 않기로 조심. 글리세롤/젤라틴 포함 4 mg/mL n 틸 gallate 또는 fluorophore 방부 제를 포함 하는 다른 설치 매체와 함께 각 섹션을 코트. 커버는 coverslip로.</li>
	<li>-20에서 슬라이드 빛 보호 컨테이너에 슬라이드를 저장 ° C. 조직 문화 접시를 헹 구 고 알코올을 사용 하 여 뚜껑에 레이블을 제거. 
	참고: 접시를 다시 사용할 수 있습니다.</li>
</ol> 5. Confocal 현미경 이미지의 수집 <ol><li>confocal 현미경, 각 fluorophore ( 그림 1A와 B)에 대 한 적절 한 레이저와 필터를 사용 하 여 고해상도 이미지를 캡처. 
	참고:이 예제에서는 confocal 현미경 사용 되었다 (재료의 표 참조). 이미지는 녹색 노란색 표시 된 항 원 특정 T 세포, 녹색 표시 CD20 표현 B 셀, 10% 전력에서 488 nm 레이저와 CD8 T 세포까지 붉은 표시에 대 한 15% 전력에서 640 nm 레이저에 대 한 20% 전력에서 561 nm 레이저를 사용 하 여 수집 되었다. 목표와 0.8의 숫자 조리개 X 20을 사용 했다.</li>
	<li>는 순차적으로 여러 800 x 800 픽셀 분야에서 3 개의 채널 간격으로 z-시리즈 3 µ m (또는 다른)를 수집합니다. 수집 된 필드의 몽타주 구성 ( 그림 1C -E). 해당 슬라이드의 정보에 따라 각 몽타주 이미지 이름을 지정 하 고 분석을 위해 저장.</li>
	<li>양적 이미지 분석 각각 confocal 현미경 분석 및 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 또는 ImageJ를 사용 하 여 수행.</li>
</ol> 6. 양적 이미지 분석 참고: 양적 이미지 분석 confocal 현미경 분석 및 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여. 여기, ImageJ 예제로 사용 되었습니다.
ImageJ 창 ( 그림 2A)에 그것을 드래그 하 여 <ol>는 confocal <li>오픈 몽타주. 
	참고: ImageJ 직접 많은 다른 confocal 현미경에 의해 수집 된 몽타주를 열 수 있습니다. 몽타주 ImageJ에서 직접 열 수 없습니다, 선택한 z-스캔 그것을 열려면 TIFF 파일로 내보냅니다</li>
	<li>선택한 z-검색 분석에 대 한 복제 (&#34; 이미지 &#34;-&#62; &#34; 복제 &#34;) ( 그림 2B).</li>
	<li>다른 채널 분할 (&#34; 이미지 &#34;-&#62; &#34; 색상 &#34;-&#62; &#34; 분할 채널 &#34;) ( 그림 2C).</li>
	<li>객관적 눌러 ROI 관리자에 그것을 추가 하는 해당 채널에서 정량 분석에 대 한 투자 수익을 그릴 &#34; T &#34; 키보드에. 면적 측정. 
	참고: ImageJ의 ROI 관리자에서는 지역 µ m 2 ( 그림 2D).</li>
	<li>형광 밝기 및 대비의 분석 채널을 조정 (&#34; 이미지 &#34;-&#62; &#34; 조정 &#34;-&#62; &#34; 밝기/대비 &#34;) ( 그림 2E).</li>
	<li>평평 이미지에 ROI (&#34; ROI 관리자 &#34;-&#62; &#34; 결합 &#34;) ( 그림 2F).</li>
	<li>계량 사용 하 여 이미지에 긍정적인 세포는 &#34; 다 지점 &#34; 도구 ( 그림 2G).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

인도 표준시 IHC와 결합 감지, 특성화, 및 항 원 특정 CD8 T 세포 다른 셀 및 조직 구조는 컨텍스트 네이티브 환경에서 측정을 위한 필수적인 도구를 제공 합니다. 여기, 우리는 인도 표준시 IHC, 이어서 양적 이미지 분석, 위치, 풍요, 붉은 털 원숭이에서 림프절에 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을 결정을 함께 결합에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다. 적용된 인간, 마우스, 또는 어떤 MHC에 대 한 다른 ?...

T 세포는 감지 및 바이러스에 감염 된 세포를 제거, 면역을 방지, B-세포 및 플라스마 세포 생산의 항 체, 그리고 감지 하 고 암 세포를 제거에 도움을 포함 하 여 많은 면역학 프로세스에 중요 합니다. 펩 티 드/MHC의 개발 종류 I 항 원 특정의 얼룩 CD8 T 세포1 와 MHC 클래스 II tetramer 얼룩이 지기의 CD4 T 세포2 의 cytometry로 최근 개발에 우리의 능력을 연구 하 고 이해 혁명 tetramer는 T 세포의 immunobiology입니다. 수량 및 항 원 특정 T 세포의 표현 형을 결정 하는 데 매우 유용한, cytometry 다른 세포와 조직, 그리고 현재 구조에 항 원 특정 T 세포의 공간 지 방화의 검출에 대 한 허용 하지 않습니다. T 세포를 추출 하는 피의 기술 필요한 cytometry에 제한 했다 비 림프 조직3에 효과.
우리와 다른 펩 티 드 로드 MHC 클래스 I 및 클래스 II tetramer 또는 multimer 시 약 조직4,,56,7, 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포 얼룩 사용 방법이 개발 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13.이 IST 메서드 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포의 표현 형의 결정에 대 한 허용 및 다른 세포와 조직에 구조 세포를 감지 하는 수단을 제공. 우리의 그룹은 광범위 하 게 사용 하는 MHC-나 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 연구-유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)-얼룩 tetramer HIV와 SIV immunopathogenesis의 이해를 얻기 위해 림프, 생식 기, 그리고 직장 조직에서 특정 CD8 T 세포 그리고 성공적인 예방 접종 전략14,15,,1617의 상관 관계를 식별 합니다. 또한, 우리 또한 개발 현장에서 교 잡 (ISH) 지역화 및 바이러스 관련 CD8 T 세포와 바이러스에 감염 된 세포를 계량 IST를 결합 하는 기술 조직에서 그리고 vivo에서 이펙터 대상 수준을 결정 하 18 , 19.
여기, 우리는 MHC 펩 티 드 로드를 사용 하 여 프로토콜을 설명-난 tetramers 얼룩 신선한 조직 섹션에 항 원 특정 CD8 T 세포에 counterstain 조직 IHC를 사용 하 여 특정 조직 구획에서 특정 고기에 포함 된 셀을 계량 하 고. 이 절차는 리 외., 어떤 우리가 결정 위치, 풍부, 및 림프 조직에 SIV 전용 T 세포의 표현 형 원숭이20에서 만성 SIV 감염 시에 의해 우리의 최근 게시물에 사용 된 것과 동일 합니다.
이 절차에 대 한 신선한 조직 구분 되며 MHC 펩 티 드 로드와 하룻밤 incubated-난 tetramers fluorescein 안산 분자 (FITC)에 활용. 그들은 다음 paraformaldehyde에 고정 됩니다. 조직, 고정 후 MHC tetramers에서 신호는 토끼 안티 FITC 항 체를 사용 하 고 붙일 태그-토끼 IgG 항 체, 바인딩된 tetramers에서 신호 증폭을 함께 알을 품을 증폭. IHC는 인도 표준시와 함께에서 항 원 특정 T 세포와 주변 셀을 특성화 하는 데 사용 됩니다. 셀의 또는 세포 외 공간에서 표면에 epitopes를 인식 하는 항 체는 tetramers와 기본 인큐베이션에 포함 됩니다. 세포내 epitopes를 인식 하는 항 체 얼룩이 지기 전에 세포 벽의 침투가 필요 합니다. 얼룩진된 조직 단면도 confocal 현미경을 사용 하 여 몇 군데는 고 confocal 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 레이블이 지정 된 셀은 공초점 현미경 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용 하 여 정량. 설명된 프로토콜 있는 MHC에 대 한 기본적으로 모든 조직에 항 원 특정 CD8 T 셀 얼룩을 사용할 수 있습니다-난 tetramers 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBL6391V</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Razor&amp;nbsp; blade</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather Disposable Scalpel</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Round paintbrush #2</td><td>PRINCETON ART &amp;amp; BRUSH CO.</td><td>4350R</td><td>Can trim as needed with razor</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

T 세포는 감지 및 바이러스에 감염 된 세포를 제거, 면역을 방지, B-세포 및 플라스마 세포 생산의 항 체, 그리고 감지 하 고 암 세포를 제거에 도움을 포함 하 여 많은 면역학 프로세스에 중요 합니다. Cytometry에 의해 분석 하는 항 원 특정 T 세포의 MHC tetramer 얼룩의 개발은 우리의 능력을 공부 하 고 이해 하는 T 세포의 immunobiology 혁명 있다. 수량 및 항 원 특정 T 세포의 표현 형을 결정 하는 데 매우 유용한, cytometry 다른 세포와 조직, 그리고 현재 피의 기술 구조에 항 원 특정 T 세포의 공간 지역화를 확인할 수 없습니다. T 추출 하 셀 필요 cytometry에 제한 했다 비 림프 조직에 효과. 제자리에서 MHC tetramer 얼룩 (IST) T 세포는 특정 조직에 대 한 관심의 항 원에 대 한 시각화 하는 기술입니다. Immunohistochemistry (IHC)와 함께, 인도 표준시 풍부, 위치, 및 조직에서 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포의 표현 형을 확인할 수 있습니다. 여기, 우리는 얼룩 특정 조직 구획 내에 있는 특정 고기와 항 원 특정 CD8 T 세포를 열거 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 절차는 동일 우리 리 외., 권리에 의해 우리의 최근 게시물에 사용 하는 "낭 CD8에 의해 부분적으로 억제에 유인원 면역 결핍 바이러스 생성 세포+ 세포 에 비보." 그들은 지역화, 표현 형, 하는 데 사용 될 수 있기 때문에 본질적으로 어떤 항 원 특정 CD8 T 세포는 MHC tetramers 사용할 수 있습니다, 어떤 조직에서 계량 설명 하는 방법을 광범위 하 게 적용 됩니다.

그림 1 에 confocal 이미지 공초점 현미경을 사용 하 여 수집 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 2 에서는 양적 이미지 분석을 ImageJ를 사용 하 여 보여 줍니다. 그림 3 과 4 대표 이미지는 SIV에서 림프절 조직의 감염 CD20 항 체와 MHC tetramers, CD8 항 체, 얼룩진 붉은 털 원숭이 쇼 그리고 MHC tetramer 얼룩의 특이성을 ?...

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In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

12.2K 조회수.  University of Minnesota. 여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

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Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it is now well established that the immune infiltrate in human tumors can correlate with prognosis and response to therapy. The analysis of the immune infiltrate in the tumor microenvironment has become a major challenge for the classification of patients and the response to treatment.
The co-expression of inhibitory receptors such as Program Cell Death Protein 1 (PD1; also known as CD279), Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Cell Immunoglobulin and Mucin Containing Protein-3 (Tim-3; also known as CD366), and Lymphocyte Activation Gene 3 (Lag-3; also known as CD223), is a hallmark of T cell exhaustion. We developed a multiparametric in situ immunofluorescence staining to identify and quantify at the cellular level the co-expression of these inhibitory receptors. On a retrospective series of frozen tissue of renal cell carcinomas (RCC), using a fluorescence multispectral imaging technology coupled with an image analysis software, it was found that co-expression of PD-1 and Tim-3 on tumor infiltrating CD8+ T cells is correlated with a poor prognosis in RCC. To our knowledge, this represents the first study demonstrating that this automated multiplex in situ technology may have some clinical relevance.

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Studying tumor microenvironment may identify prognostic or predictive biomarkers of clinical response to immunotherapy. Presented here, is an innovative method based on in situ fluorescence multispectral imaging to analyze and count automatically various subpopulations of CD8+ T cells. This reproducible and reliable technique is suitable for large cohort analyses.

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

연구

암 연구학

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

면역학 및 감염병학

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

생물학

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석<sup&gt; +</sup&gt; 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Isolation and Characterization of Antigen-Specific T cells in Mouse Lungs(마우스 폐에서 항원 특이적 T 세포의 분리 및 특성 분석)

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

저자 스포트라이트: Tetramers를 사용하여 마우스 폐에서 항원 특이적 T 세포를 검출하기 위한 최적화된 프로토콜

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

펩타이드를 이용한 생쥐 폐의 희귀 항원 특이적 T 세포 식별: 주요 조직적합성 복합체 테트라머

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

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