Questo lavoro è stato supportato dal servizio di sanità pubblica concede dal National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. giorno 1: taglio di tessuto fresco e incubazione primaria <ol><li>uso un bisturi per tagliare il tessuto fresco in pezzi piccoli (circa 0,5 cm di larghezza di 0,5 cm di altezza). Separatamente ogni tessuto per un pistone per colla e incorporarli con 3-5 mL dell'agarosi di basso-fusione di 4% in PBS. Etichettare il pistone con le informazioni di tessuto usando un adesivo. Metterlo in un supporto refrigerato in un secchio di ghiaccio per solidificare.</li>
	<li>Accendere il microtomo e impostare lo spessore delle sezioni a 200 µm. installa una lama di rasoio sulle microtomo e inserire lo stantuffo montato con il tessuto nel bagno microtomo.</li>
	<li>Preparare il tampone fosfato salino con eparina (PBS-H) aggiungendo 100 µ g/mL o 18,7 eparina U/mL di PBS per preservare il RNA e per consentire applicazioni ISH potenziali a valle. Riempire la vasca di microtomo, che copre il tessuto incorporato, con 100-120 mL di PBS-h refrigerati, sterile. Aggiungere cubetti di ghiaccio di PBS-H per il bagno per mantenere la temperatura a 0 - 2 ° C. Start il microtomo e tagliare il tessuto in 200 µm sezioni. 
	Nota: È importante mantenere i tessuti refrigerati sul ghiaccio per ridurre al minimo l'attività cellulare all'interno dei tessuti e perché tessuto fresco è più facile sezione quando è freddo. PBS da solo può essere utilizzato se non ci sono piani per ISH a valle.</li>
	<li>In alternativa, per i tessuti che non tagliano bene con un microtomo (ad es., intestino e polmone), utilizzare un bisturi o una lama di rasoio per tagliare il tessuto in strisce sottili come vicino possibile a 200 µm.</li>
	<li>Etichetta il coperchio di piastre di coltura del tessuto 24 pozzetti con le informazioni del campione sperimentale e posizionare gli alloggiamenti di tessuto nei pozzetti corrispondenti. Refrigerati utilizza un pennello per trasferire le sezioni a una camera di tessuto insieme nel pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti contenente 1 mL di PBS-H. 
	Nota: Tessuto riutilizzabile camere dovrebbero essere fatto prima di iniziare la colorazione. Alloggiamenti del tessuto possono essere fatto utilizzando una provetta di snap con tappo rotondo-fondo in polipropilene 14 mL e rete metallica. Utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare sul fondo di una provetta di-salvapercussore rotondo-fondo in polipropilene 14 mL. Tagliare la rete metallica in cerchio per essere inserito nel foro nella parte inferiore del tubo. Calore il cerchio di maglia di filo con un becco Bunsen fino a quando è rovente. Impostare il cerchio di maglia di filo molto rapidamente e spingere il tubo sulla mesh. Verificare che la rete metallica è saldamente fissato alla parte inferiore del tubo e poi accuratamente tagliato fuori dalla parte superiore del tubo presso il marchio di 3 mL utilizzando una lama di rasoio affilata. Inserire fino a 3 sezioni di tessuto in ogni camera di tessuto, o fino a 1 cm 2 di tessuto per pozzetto. Mantenere almeno un pozzo vuoto tra pozzetti con combinazioni di diversi anticorpi per evitare la contaminazione incrociata.</li>
	<li>Procedere al primario tetramero e anticorpo che macchia immediatamente dopo aver terminato il trasferimento di tutte le sezioni di taglio negli alloggiamenti del tessuti. Mantenere le sezioni sommerso e refrigerati in 1 mL di PBS-H a tutte le ore.</li>
	<li>Incubare le sezioni di tessuto durante la notte con 0,5 µ g/mL di coniugato FITC, peptide-caricato MHC-I tetrameri diluiti in PBS-H con 2% di siero di capra normale (NGS). Includono mouse o altri non-coniglio anticorpi direzionati alle epitopi extracellulari di interesse in questa incubazione (per esempio, gli anticorpi di anti-CD8 ratto diluito 1: 500 in PBS-H con 2% NGS). Posizionare 1 mL di anticorpi diluiti in ciascun pozzetto. 
	Nota: Occorre prestare attenzione quando si selezionano gli anticorpi CD8, come alcuni possono migliorare e alcuni in grado di inibire i tetrameri MHC vincolante a cellula T recettori 4 , 21. L'anticorpo di CD8 anti-umano di ratto descritto qui è instabile e a volte risulta in colorazione un po' debole. È usato qui per etichettatura triple perché è l'unico non-coniglio e CD8 non-anticorpo testato che le cellule T CD8 di macaco rhesus macchiato.</li>
	<li>Utilizzare 1 mL di soluzione ogni pozzetto per l'anticorpo primario e tutti i successivi incubazioni ed eseguire questo e tutti i successivi dopo incubazione a 4 ° C, con le piastre su una piattaforma a dondolo. 
	Nota: Tessuti devono galleggiare liberamente nella camera.</li>
</ol> 2. Giorno 2: Fissazione e incubazione secondario <ol><li>dopo l'incubazione primaria, lavare le sezioni due volte con 1 mL di PBS-H refrigerati per 20 min ogni lavaggio. Fare questo trasferendo gli alloggiamenti del tessuto ad una piastra di coltura di tessuti diversi 24 pozzetti contenente 1 mL di PBS-H refrigerati nei pozzetti corrispondenti. 
	Nota: Fare attenzione a non gocciolare contenuto da un campione sperimentale in un altro, quando si spostano tra camere di tessuto. Per tutte le successive incubazioni e lavaggi, allo stesso modo trasferire camera del tessuto per un piatto pulito contenente la soluzione appropriata. Assicuratevi di controllare le sezioni negli alloggiamenti del tessuto durante la procedura per assicurarsi che le sezioni non si blocca ai lati delle sezioni del tessuto. Se essi, spingere indietro nella soluzione.</li>
	<li>Fissare le sezioni con 1 mL di fresco paraformaldeide 4% tamponata con PBS per 2 h a temperatura ambiente (non sopra-difficoltà). Lavare con PBS freddo-H due volte per 5 min. 
	Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare adeguati dispositivi di protezione personale. 
	Nota: Se il ricupero dell'antigene e permeabilizzazione è necessario per rilevare gli epitopi intracellulari, antigeni possono essere recuperati facendo bollire le sezioni nell'urea di 0.01 mol dopo la fissazione del paraformaldeide.</li>
	<li>Trasferire le sezioni in piastre di coltura 24 pozzetti contenenti 0,01 mol urea e collocare questi piatti nel forno a microonde. Bollire le sezioni tre volte per circa 10 s ciascuno, per un totale di 30 s. 
	Nota: State molto attenti, come bollire la soluzione possibile forzare le sezioni dalle fonti. Se questo accade, è possibile utilizzare un pennello a riportare le sezioni dai lati della camera del tessuto o dal coperchio della piastra nella parte inferiore della camera del tessuto appropriato.</li>
	<li>Prima per l'incubazione di anticorpo secondario, permeabilize e bloccare le sezioni di tessuto di incubarle in blocco soluzione contenente PBS-H, 0,3% detergente (PBS-H-T) e 2% NGS su un rocker per 1 h a 4 ° C. eseguire successive le incubazioni dell'anticorpo con NGS PBS-H-T/2%.</li>
	<li>Per l'incubazione secondaria, trasferire le sezioni negli alloggiamenti del tessuto a pozzetti contenenti coniglio anti-FITC anticorpo diluito 1: 10.000 in PBS-H-T/2% NGS. Incubare per una notte.</li>
	<li>Eseguire una colorazione di contrasto utilizzando anti-CD20 anticorpo diluito 1: 200 in PBS-H-T/2% NGS. Per questa opzione, recuperare gli epitopi se necessario, permeano le cellule e bloccare prima del termine dell'incubazione, come descritto in precedenza.</li>
</ol> 3. Giorno 3: Terziario incubazione <ol><li>dopo la seconda incubazione, lavare le sezioni tre volte in PBS-H a 4 ° C per almeno 20 min.</li>
	<li>Eseguire un'incubazione finale con l'appropriato con l'etichetta fluorescente anticorpi (ad es., capra anti-coniglio coniugato giallo-verdastro, colorante lontano rosso coniugati di capra anti-ratto e capra anti-topo coniugata colorante verde anticorpi diluito 1:5, 000, 1:5, 000 e 1:2, 000, rispettivamente, in PBS-H-T/2% NGS). Incubare per una notte. 
	Nota: A questo punto, l'incubazione può essere estesa fino a tre giorni se necessario. Mantenere le sezioni protette dalla luce avvolgendo le piastre in carta stagnola durante questo incupassaggio di Angela e, successivamente, come luce disseta fluorofori.</li>
</ol> 4. Giorno 4: Montaggio delle sezioni <ol><li>lavare le sezioni tre volte in PBS-H per almeno 20 min. 
	Nota: Se la pianificazione per downstream ISH 19, fissare le sezioni in paraformaldeide al 4% per 1 h per garantire i tetrameri e anticorpi in luogo e poi lavare le sezioni due volte con PBS-H per 5 minuti ciascuno. 
	Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare adeguati dispositivi di protezione personale.</li>
	<li>Utilizzare un pennello per trasferire le sezioni su un vetrino da microscopio. Fare attenzione a non colpire il tessuto troppo. Spalmate ogni sezione glicerolo/gelatina contenente 4 mg/mL n-propyl gallate o un altro mezzo di montaggio contenente un fluoroforo conservante. Coprire con un vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Conservare i vetrini in un contenitore protetto da luce diapositiva a -20 ° C. lavare le piastre di coltura del tessuto e rimuovere le etichette sui coperchi utilizzando alcool. 
	Nota: Le piastre possono essere riutilizzate.</li>
</ol> 5. Acquisizione di immagini al microscopio confocale <ol><li>cattura immagini ad alta risoluzione con un microscopio confocale, utilizzando il laser appropriato e filtri per ogni fluoroforo ( Figura 1A e B). 
	Nota: In questo esempio, (Vedi la Tabella materiali) è stato utilizzato un microscopio confocale. Immagini sono state raccolte utilizzando il 561 nm laser al 20% di energia per le cellule di T antigene-specifiche con etichetta giallo verdastre, il laser di 488 nm a potenza del 10% per le cellule di B che esprimono CD20 con etichetta verde e il laser di 640 nm a 15% di potenza per le cellule di T di CD8 lontano rosso-etichettati. Sono stati utilizzati il 20X obiettivo e un'apertura numerica di 0.8.</li>
	<li>Raccogliere in sequenza di intervalli di z-serie a 3 µm (o altro) nei tre canali in più campi di 800 x 800 pixel. Costruire un montaggio dei campi raccolti ( Figura 1 -E). Nome di ogni immagine di montaggio sulla base delle informazioni della diapositiva corrispondente e salvare per l'analisi.</li>
	<li>Eseguire analisi quantitativa delle immagini utilizzando il software di analisi e quantificazione del rispettivo microscopio confocale o ImageJ.</li>
</ol> 6. Analisi quantitativa delle immagini Nota: analisi quantitativa delle immagini possono essere realizzato utilizzando software di analisi e quantificazione del microscopio confocale o utilizzando il software ImageJ. Qui, ImageJ è stata usata come esempio.
<ol><li>Open al confocale montage trascinandolo nella finestra di ImageJ ( Figura 2A). 
	Nota: ImageJ può aprire direttamente raccolti da molti microscopi confocali diversi montaggi. Se il montaggio non può essere aperto direttamente da ImageJ, esportare il z-scan selezionato come file TIFF per aprire it.</li>
	<li>Duplicare la z-scan selezionato per l'analisi (&#34; immagine &#34;-&#62; &#34; duplicare &#34;) ( Figura 2B).</li>
	<li>Dividere i diversi canali (&#34; immagine &#34;-&#62; &#34; colore &#34;-&#62; &#34; canali Split &#34;) ( Figura 2).</li>
	<li>Disegnare il ROI per l'analisi quantitativa nel canale corrispondente per essere obiettivo e aggiungerlo al gestore di ROI premendo &#34; T &#34; sulla tastiera. Misurare l'area. 
	Nota: Il gestore di ROI di ImageJ Mostra l'area in µm 2 ( Figura 2D).</li>
	<li>Regolare la fluorescenza luminosità e contrasto del canale da analizzare (&#34; immagine &#34;-&#62; &#34; regolare &#34;-&#62; &#34; luminosità/contrasto &#34;) ( Figura 2E).</li>
	<li>Appiattire il ROI sull'immagine (&#34; manager ROI &#34;-&#62; &#34; Flatten &#34;) ( Figura 2F).</li>
	<li>Quantificare le cellule positive nell'immagine utilizzando il &#34; multi-punto &#34; strumento ( Figura 2).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

IST combinato con IHC fornisce uno strumento essenziale per rilevare, caratterizzare e quantificare le cellule CD8 T antigene-specifiche in ambienti nativi con il contesto di altre cellule e strutture del tessuto. Qui, abbiamo descritto le procedure dettagliate per IST combinato con IHC, seguita da analisi dell'immagine quantitativa, per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T CD8 antigene-specifiche nei linfonodi da macachi rhesus. Macchiatura simile può essere applicata all'essere umano, del mou...

Le cellule T sono fondamentali per molti processi immunologici, compreso rilevazione ed eliminando le cellule infettate da virus, impedendo l'autoimmunità, assistendo nella produzione delle cellule di B e delle cellule di plasma di anticorpi e rilevare ed eliminare le cellule tumorali. Lo sviluppo del peptide/MHC di classe I tetramero macchiatura di antigene-specifiche le cellule CD8 T1 e il più recente sviluppo di MHC classe II tetramero macchiatura delle cellule di T CD42 tramite flusso cytometry ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare e comprendere la immunobiologia delle cellule T. Mentre estremamente utile per determinare la quantità e il fenotipo delle cellule T antigene-specifiche, citometria a flusso non consente la rilevazione della localizzazione spaziale delle cellule T antigene-specifiche ad altre cellule e strutture nei tessuti e corrente tecniche di disaggregazione per estrarre le cellule T necessari per citometria a flusso hanno limitato l'efficacia in tessuti non linfoidi3.
Noi ed altri abbiamo sviluppato metodi utilizzando peptide-caricato MHC di classe I e classe II tetramer o multimer reagenti per macchiare le cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche in tessuti4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST questi metodi consentono la determinazione della posizione, abbondanza e fenotipo di cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche nei tessuti e forniscono un mezzo per rilevare di queste celle relative altre cellule e strutture nei tessuti. Il nostro gruppo ha utilizzato estesamente MHC-ho tetramero macchiatura per studiare il virus di immunodeficenza umana (HIV) - e virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) - cellule di T di CD8 specifiche nei tessuti linfoidi, genitale e rettale per acquisire una comprensione di HIV e SIV immunopatogenesi e per identificare correlazioni di vaccinazione successo strategie14,15,16,17. Inoltre, abbiamo anche sviluppato una tecnica che combina IST con ibridazione in situ (ISH) di localizzare e quantificare le cellule T CD8 specifici virus e cellule infettate da virus nei tessuti e di determinare i livelli di effettore--obiettivo in vivo 18 , 19.
Qui, descriviamo un protocollo utilizzando peptide-caricato MHC-I tetrameri per macchiare le cellule CD8 T antigene-specifiche nelle sezioni di tessuto fresco, a tessuti controcolorazione con IHC e quantificare le cellule con fenotipi specifici nei compartimenti tissutali specifici. Queste procedure sono le stesse sono state usate nella nostra recente pubblicazione da Li et al., in cui abbiamo determinato la posizione, l'abbondanza e fenotipo delle cellule di T di SIV-specific in tessuto linfoide durante l'infezione cronica di SIV in macachi20.
Per questa procedura, tessuti freschi sono sezionate e incubate durante la notte con caricamento del peptide di MHC-I tetrameri coniugati a molecole di tiocianato di fluorescina (FITC). Quindi sono fissati in paraformaldeide. Dopo aver sistemato il tessuto, il segnale dai tetrameri MHC viene amplificato usando gli anticorpi di coniglio anti-FITC e incubate con anticorpi di IgG di anti-coniglio fluorescente contrassegnati, che amplificano ulteriormente il segnale dai tetrameri associati. IHC è utilizzato in combinazione con IST per caratterizzare le cellule T antigene-specifiche e le cellule circostanti. Gli anticorpi che riconoscono epitopi sulla superficie delle cellule o nello spazio extracellulare sono inclusi in incubazione primaria con i tetrameri. Gli anticorpi che riconoscono epitopi intracellulari richiedono permeazione della parete della cellula prima della colorazione. Le sezioni di tessuto macchiato sono Imaging utilizzando un microscopio confocale e analizzati utilizzando software confocale. Cellule con etichettate vengono quantificate utilizzando software di microscopia confocale o ImageJ. Il protocollo descritto può essere utilizzato a macchiare essenzialmente qualsiasi cellule CD8 T antigene-specifiche in qualsiasi tessuto per cui MHC-I tetrameri sono disponibili.

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBL6391V</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Razor&amp;nbsp; blade</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather Disposable Scalpel</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Round paintbrush #2</td><td>PRINCETON ART &amp;amp; BRUSH CO.</td><td>4350R</td><td>Can trim as needed with razor</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

Le cellule T sono fondamentali per molti processi immunologici, compreso rilevazione ed eliminando le cellule infettate da virus, impedendo l'autoimmunità, assistendo nella produzione delle cellule di B e delle cellule di plasma di anticorpi e rilevare ed eliminare le cellule tumorali. Lo sviluppo di MHC-tetramero macchiatura delle cellule T antigene-specifiche analizzate tramite flusso cytometry ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare e comprendere l'immunobiologia delle cellule T. Mentre estremamente utile per determinare la quantità e il fenotipo delle cellule T antigene-specifiche, citometria a flusso non può determinare la localizzazione spaziale delle cellule T antigene-specifiche ad altre cellule e strutture nei tessuti e le attuali tecniche di disaggregazione per estrarre le T cellule necessarie per citometria a flusso hanno un'efficacia limitata in tessuti non linfoidi. In situ MHC-tetramero macchiatura (IST) è una tecnica per visualizzare le cellule T che sono specifiche per gli antigeni di interesse nei tessuti. In combinazione con immunohistochemistry (IHC), IST può determinare l'abbondanza, la posizione e il fenotipo delle cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche nei tessuti. Qui, descriviamo un protocollo per macchiare ed enumerare le cellule CD8 T antigene-specifiche, con specifici fenotipi che si trova all'interno di compartimenti tissutali specifici. Queste procedure sono le stesse che abbiamo usato nella nostra recente pubblicazione da Li et al., intitolato "cellule producenti su Virus dell'immunodeficienza delle scimmie in follicoli sono parzialmente soppresso da CD8+ cellule In Vivo." I metodi descritti sono ampiamente applicabili perché può essere utilizzati per localizzare, fenotipo e quantificare essenzialmente qualsiasi cella di CD8 T antigene-specifiche per cui i tetrameri MHC sono disponibili, in tutto il tessuto.

Figura 1 Mostra come raccogliere immagini confocal utilizzando un microscopio confocale. Nella figura 2 viene illustrata l'analisi quantitativa immagine usando ImageJ. Figure 3 e 4 indicano rappresentante immagini dei tessuti di linfonodo da un SIV infettati macaco rhesus macchiato con tetrameri MHC, CD8 anticorpi e anticorpi CD20 e servono a dimostrare la specificità della MHC-tetramero coloraz...

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In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Qui, descriviamo un metodo che unisce in situ MHC-tetramero colorazione immunoistochimica per determinare la localizzazione, fenotipo e la quantità di cellule T antigene-specifiche nei tessuti. Questo protocollo viene utilizzato per determinare le caratteristiche spaziali e fenotipiche delle cellule CD8 T antigene-specifiche rispetto a strutture in tessuti e altro tipo di cellula.

In Situ MHC-tetramero macchiatura e analisi quantitativa per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T antigene-specifiche CD8 nei tessuti

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

12.2K Views.  University of Minnesota. Qui, descriviamo un metodo che unisce in situ MHC-tetramero colorazione immunoistochimica per determinare la localizzazione, fenotipo e la quantità di cellule T antigene-specifiche nei tessuti. Questo protocollo viene utilizzato per determinare le caratteristiche spaziali e fenotipiche delle cellule CD8 T antigene-specifiche rispetto a strutture in tessuti e altro tipo di cellula.

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Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it is now well established that the immune infiltrate in human tumors can correlate with prognosis and response to therapy. The analysis of the immune infiltrate in the tumor microenvironment has become a major challenge for the classification of patients and the response to treatment.
The co-expression of inhibitory receptors such as Program Cell Death Protein 1 (PD1; also known as CD279), Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Cell Immunoglobulin and Mucin Containing Protein-3 (Tim-3; also known as CD366), and Lymphocyte Activation Gene 3 (Lag-3; also known as CD223), is a hallmark of T cell exhaustion. We developed a multiparametric in situ immunofluorescence staining to identify and quantify at the cellular level the co-expression of these inhibitory receptors. On a retrospective series of frozen tissue of renal cell carcinomas (RCC), using a fluorescence multispectral imaging technology coupled with an image analysis software, it was found that co-expression of PD-1 and Tim-3 on tumor infiltrating CD8+ T cells is correlated with a poor prognosis in RCC. To our knowledge, this represents the first study demonstrating that this automated multiplex in situ technology may have some clinical relevance.

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Studying tumor microenvironment may identify prognostic or predictive biomarkers of clinical response to immunotherapy. Presented here, is an innovative method based on in situ fluorescence multispectral imaging to analyze and count automatically various subpopulations of CD8+ T cells. This reproducible and reliable technique is suitable for large cohort analyses.

Multiplexed immunofluorescenza analisi e quantificazione di Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T cellule

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Peptide: MHC Tetramero basata Arricchimento di epitopi specifici per cellule T

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Immunologia e infezioni

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Biologia

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

Trapianto di tumore per valutare la dinamica delle cellule T CD8+ infiltranti il tumore nei topi

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

In Situ Rilevamento di Autoreattivi CD4 cellule T nel cervello e nel cuore Utilizzo Maggiore di Istocompatibilità Dextramers classe Complex II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Una tecnica di visualizzare contemporaneamente Virus specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

L&#39;analisi dei Simian Immunodeficiency Virus specifici CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-cellule in Rhesus macachi di peptide-MHC-I Tetramero colorazione

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Determinazione quantitativa simultanea delle anti-vettore e Anti-transgene-Specific CD8+ T cellule tramite MHC I tetramero colorazione dopo la vaccinazione con un vettore virale

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Isolamento e caratterizzazione di cellule T antigene-specifiche nei polmoni di topo

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

Autore in primo piano: Protocollo ottimizzato per il rilevamento di cellule T antigene-specifiche nei polmoni di topo utilizzando i tetrameri

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

Identificazione di rare cellule T antigene-specifiche da polmoni di topo con tetrameri del complesso peptide:istocompatibilità maggiore

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

In Situ MHC-tetramero macchiatura e analisi quantitativa per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T antigene-specifiche CD8 nei tessuti

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