Bu eser tarafından desteklenmiştir halk sağlığı hizmeti verir Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. gün 1: taze doku kesit ve birincil kuluçka <ol><li>kullanımı bir neşter taze doku küçük (yaklaşık 0.5 cm geniş x 0.5 cm boyunda) parçalar halinde kesilmiş. Ayrı ayrı her dokusu bir dalgıç ile tutkal ve PBS içinde 3-5 mL ile % 4 düşük-melt özel katıştırabilirsiniz. Pistonu bir etiket kullanarak doku bilgileri ile etiketleyin. Nedense odamızda buz kovası içinde soğutulmuş bir sahibi katılaşmaya koymak.</li>
	<li>Microtome ve 200 µm. yükleme jilet microtome ve INSERT pistonu bölümlerine kalınlığı monte microtome banyoda dokusuyla kümesi açın.</li>
	<li>Fosfat tamponlu tuz heparin (PBS-H) ile 100 µg/mL veya 18.7 U/mL heparin PBS RNA korumak için ve potansiyel ISH uygulamalar aşağı izin vermek için ekleyerek hazırlayın. Katıştırılmış dokuyla soğutulmuş, steril PBS-h 100-120 mL kapsayan microtome banyo doldurmak 0 - sıcaklıkta korumak için Bath'a PBS-H buz küpleri ekleyin 2 ° C. Başlat microtome ve kesim 200 µm bölümleri dokusuna. 
	Not: Dokularda hücresel hareketlilik en aza indirmek buzda soğutulmuş doku tutmak önemlidir ve o soğutulmuş taze doku bölümüne daha kolay olduğu için. PBS yalnız-ebilmek var olmak kullanılmış Eğer aşağı akım ISH için bir planımız.</li>
	<li>İyi bir microtome ile (Örneğin, bağırsak ve akciğer), kesmeyin dokuları kullanmak için bir bistüri veya jilet doku ince şeritler halinde kesmek için alternatif olarak, 200 µm mümkün olduğunca yakın.</li>
	<li>Deneysel örnek bilgiler ile 24-iyi doku kültürü plakalar kapak etiketi ve karşılık gelen wells için yapılan doku chambers yerleştirin. Bölümleri bir doku odasına aktarmak için bir fırça set 1 mL içeren bir 24-iyi doku kültürü kalıbının kuyuya kullanım soğutulmuş PBS-H. 
	Not: Yeniden kullanılabilir doku chambers boyama başlatmadan önce yapılmalıdır. Doku Odalar bir 14 mL polipropilen yuvarlak alt ek-Kapiler tüp kullanılarak yapılabilir ve Kafes Tel. Bir 14 mL polipropilen yuvarlak alt ek-Kapiler tüp alt kesmeye keskin jilet kullanın. Tel örgü tüpün dibinde delik uyacak bir daire kes. Isı kadar kızgın Bunsen burner kullanarak tel kafes daire. Tel kafes daire çok hızlı bir şekilde aşağı ayarlamak ve tüp mesh itin. Tel örgü güvenli bir şekilde tüp altına yapıştırılmış ve tüp keskin jilet kullanarak 3 mL işareti üst kapalı dikkatle kesin emin olun. İlâ 3 doku bölümleri her doku odasına veya en çok 1 cm 2 doku iyi başına koy. Wells Çapraz bulaşma kaçınmak için farklı antikor kombinasyonları ile arasında en az bir boş şey devam.</li>
	<li>Devam et için birincil tetramer ve hemen tüm kesme bölümleri transfer doku odaları içine bitirdikten sonra boyama antikor. Sular altında ve her zaman PBS-H 1 mL soğutulmuş bölümlerine devam.</li>
	<li>Kuluçkaya doku bölümlerle gecede 0,5 µg/mL FITC Birleşik, peptid yüklü MHC-ben tetramers PBS-H %2 normal keçi serum (NGS) ile seyreltilmiş. Fare veya hücre dışı epitopları bu kuluçka ilgi yönelik diğer tavşan olmayan antikorlar içerir (Örneğin, fare anti-CD8 antikorlar PBS-h %1:500 2 ile seyreltilmiş NGS). Her kuyuya 1 mL sulandırılmış antikorları yerleştirin. 
	Not: CD8 antikorlar, bazı artırabilir ve bazı T hücre reseptörü 4 , 21 ' e bağlama MHC tetramers engellediğini seçerken özen gösterilmelidir. Burada açıklanan fare Anti-insan CD8 antikor kararsız ve bazen biraz zayıf boyama sonuçlanmaktadır. O burada çünkü bu tek sigara-tavşan ve fare CD8 antikor test o lekeli rhesus makak CD8 T hücreleri Üç Kişilik etiketleme için kullanılır.</li>
	<li>1 mL çözeltisi iyi birincil antikor ve sonraki tüm incubations için kullanın ve bu ve tüm izleyen incubations sallanan bir platformda plakalı 4 ° C'de gerçekleştirmek. 
	Not: Doku serbestçe odasında float.</li>
</ol> 2. 2. gün: Fiksasyon ve ikincil kuluçka <ol><li>birincil kuluçka sonra soğutulmuş PBS-H 20 min için 1 mL ile iki kez bölümlerini her yıkama yıkamak. Bunu karşılık gelen Wells soğutulmuş PBS-h 1 mL içeren bir farklı 24-iyi doku kültürü plakasına doku chambers aktararak. 
	Not: içindekiler--dan bir deneysel örneği diğerinin içine doku odaları arasında taşırken damla değil dikkatli olun. Benzer şekilde tüm sonraki incubations ve yıkama için doku odası uygun bir çözüm içeren temiz bir tabağa aktarın. Doku chambers bölümlerde bölümleri doku chambers taraf için sıkışmış değil emin olmak için yordamı sırasında izlemek emin olun. Eğer çözüm içine onlar geri onları itmek.</li>
	<li>1 mL taze PBS tamponlanmış %4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 2 h ile bölümleri düzeltmek (aşırı düzeltmek değil). Soğuk PBS-H iki kez 5 dakika süreyle ile yıkama 
	Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. 
	Not: Eğer hücre içi epitopları algılamak için antijen alma ve permeabilization tabi, antijenleri paraformaldehyde fiksasyon sonra 0.01 mol üre bölümlerde kaynatılarak alınabilir.</li>
	<li>Bölümleri 0,01 mol üre içeren 24-şey kültür kalıplara aktarmak ve bu plakaları bir mikrodalga fırında yerleştirin. Üç kez için yaklaşık 10 bölümleri kaynatın s 30 olmak üzere toplam her s. 
	Not: çok dikkat et, kaynar olarak çözüm bölümleri dışında kuyuları zorlayabilirsiniz. Bu durumda, bölümleri doku odasının tarafında veya kapak plaka uygun doku odası altına geri itmek için bir fırça kullanın.</li>
	<li>Önceden ikincil antikor kuluçka için permeabilize ve doku bölümleri PBS-H, % 0.3 deterjan (PBS-H-T) ve % 2 içeren engelleme çözümde kuluçka tarafından blok NGS bir rocker 4 ° C. gerçekleştir sonraki antikor incubations ile 1 h için üzerinde PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>İkincil kuluçka için tavşan anti-FITC seyreltilmiş antikor 1:10,000 PBS-H-T/2% NGS içeren wells doku chambers bölümlerde aktarmak. Gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Yerine counterstaining kullanarak fare anti CD20 antikor 1: 200 PBS-H-T/2% NGS içinde seyreltilmiş. Bu seçenek için gerekirse epitopları almak, hücreleri nüfuz ve yukarıda açıklandığı gibi bu kuluçka önce engellemek.</li>
</ol> 3. 3. gün: Üçüncül kuluçka <ol><li>sonra ikinci kuluçka, balıklarda üç kez PBS-H en az 20 dakika süreyle 4 ° C'de yıkama</li>
	<li>İle ilgili son bir kuluçka fluorescently antikorlar (Örneğin, keçiyi Anti-tavşan yeşilimsi sarı, keçi Anti-sıçan konjuge kadar kırmızı boya ve keçi Anti-fare konjuge yeşil boya antikorlar seyreltilmiş 1:5, 000, Birleşik etiketli gerçekleştirmek 1:5, 000, 000 ve 1:2, sırasıyla, PBS-H-T/2% NGS içinde). Gecede kuluçkaya. 
	Not: Bu noktada, kuluçka üç gün boyunca gerekirse genişletilebilir. Tabakları kalay folyo içinde bu incu sırasında sarma tarafından ışıktan korunan bölümleri tutmakbation adım ve bundan sonra ışık fluorophores quenches gibi.</li>
</ol> 4. 4. gün: bölümleri montaj <ol><li>yıkama bölümler üç kez PBS-H içinde en az 20 dk. 
	Not: Eğer aşağı akım ISH 19 için planlama, 1 h için %4 paraformaldehyde bölümlerde tetramers ve antikorlar yerde güvenli ve sonra yıkayın PBS-H 5 min için iki kez bölümlerle düzeltmek için. 
	Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun kişisel koruyucu ekipman giymek.</li>
	<li>Bölümleri mikroskop slayda aktarmak için bir fırça kullanın. Çok fazla doku poke değil dikkatli olun. Her bölümün gliserol/jelatin içeren 4 mg/mL n-propil gallat veya bir fluorophore koruyucu içeren başka bir montaj orta kat. Kapak ile coverslip.</li>
	<li>-20, bir ışık korumalı slayt kapsayıcısında slaytları depolamak ° C. doku kültürü plakaları durulama ve kapakları alkol kullanarak etiketlerinizi kaldırın. 
	Not: Tabakları kullanılabilmesinden.</li>
</ol> 5. Confocal mikroskop görüntüleri edinimi <ol><li>confocal mikroskop her fluorophore ( şekil 1A ve B) için uygun lazerler ve filtreleri kullanarak, yakalama yüksek çözünürlüklü görüntülerle. 
	Not: Bu örnekte, confocal mikroskop (Tablo reçetesi görmek) kullanıldı. Görüntüleri yeşilimsi sarı etiketli antijen spesifik T hücreleri, % 10 güç 488-nm lazer yeşil etiketli CD20 ifade etme B hücreleri için ve % 15 güç 640-nm lazer kadar kırmızı etiketli CD8 T hücreler için % 20 güç 561 nm lazer kullanılarak toplanmıştır. 20 X objektif ve sayısal bir diyafram 0,8 kullanıldı.</li>
	<li>Sırayla birden fazla 800 x 800 piksel alanlarda üç kanal z-serisi 3 µm (veya diğer) aralıklarla toplamak. Bir montaj toplanan alanlarının oluşturmak ( şekil 1 c -E). Karşılık gelen slayt bilgilerini temel alarak her montaj görüntü adı ve çözümlemeyi kaydetmek.</li>
	<li>İlgili confocal mikroskop analizi ve miktar yazılım veya ImageJ kullanarak sayısal görüntü analizi gerçekleştirmek.</li>
</ol> 6. Sayısal görüntü analizi Not: sayısal görüntü analizi confocal mikroskop analizi ve miktar yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir veya ImageJ yazılım kullanarak. Burada, ImageJ örnek olarak kullanılmıştır.
<ol><li>Açık bir confocal montaj ( şekil 2A) ImageJ penceresine sürükleyerek. 
	Not: ImageJ birçok farklı confocal mikroskoplar tarafından toplanan montages doğrudan açabilirsiniz. Montaj ImageJ tarafından doğrudan açılamaz Eğer z-tarama onu açmak için TIFF dosyaları olarak dışa aktarmak</li>
	<li>Seçilen z tarama analizi için yinelenen (&#34; görüntü &#34;-&#62; &#34; yinelenen &#34;) ( şekil 2B).</li>
	<li>Farklı Kanallar split (&#34; görüntü &#34;-&#62; &#34; renk &#34;-&#62; &#34; Split kanalları &#34;) ( şekil 2C).</li>
	<li>Objektif ve basarak ROI yöneticisi eklemek için karşılık gelen kanal YG nicel analiz çizmek &#34; T &#34; üstünde belgili tanımlık klavye. Tedbir alan. 
	Not: ImageJ yatırım Getirisi Müdürü alan gösterir µm 2 ' ( şekil 2B).</li>
	<li>Floresan parlaklık ve kontrast çözümlenmesi için kanal (&#34; görüntü &#34;-&#62; &#34; ayarla &#34;-&#62; &#34; Parlaklık/Kontrast &#34;) ( şekil 2E).</li>
	<li>Yatırım Getirisi Görüntüye Düzleştir (&#34; ROI Yöneticisi &#34;-&#62; &#34; Flatten &#34;) ( şekil 2F).</li>
	<li>Görüntü kullanarak pozitif hücrelerinin ölçmek &#34; çok noktalı &#34; aracı ( Şekil 2 g).</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4%28%2B%29+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li>
<li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432944">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HLA-DR%2A08032%2FE7+and+HLA-DR%2A0818%2FE7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4%2B+T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li>
<li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific%2C+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519(2014).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679(2014).</li>
<li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4%2B+T+Cells+in+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).</li>
<li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8%2B+cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li>
<li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0004131">Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).</li>
<li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV%CE%94nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8%2B+T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561(2009).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8%2B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li>
<li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

IHC ile kombine IST tespit, karakterize ve antijen spesifik CD8 T hücreleri diğer hücre ve doku yapıları bağlamı ile doğal ortamlarda miktarının için gerekli bir araç sağlar. Burada, biz fenotip antijen spesifik CD8 T hücrelerinin rhesus makak lenf düğümleri, bereket ve konumunu belirlemek için nicel görüntü analizi tarafından takip IHC ile birlikte IST için ayrıntılı yordamlar nitelendirdi. Benzer boyama uygulanan insan, fare veya diğer türler doku hangi MHC için olabilir-ben tetramers mevcu...

T hücreleri gibi algılama ve virüs bulaşan hücreleri ortadan kaldırarak, otoimmüniteye önlenmesi, antikor ve algılama ve kanser hücrelerinin eleme B-hücreli ve plazma hücreli üretimde yardımcı birçok immünolojik işlemlere için önemlidir. Geliştirme peptit/MHC sınıf ı antijen spesifik boyama CD8 T hücreleri1 ve MHC sınıf II tetramer CD4 T hücre2 / Akış Sitometresi tarafından boyama daha yeni geliştirme çalışması ve anlamak yeteneğimizi devrim tetramer immunobiology T hücrelerinin. Son derece yararlı olsa da miktar ve fenotip antijen spesifik T hücreleri belirlemek için Akış Sitometresi diğer hücreleri ve yapıları dokularda ve geçerli antijen spesifik T hücrelerinin kayma yerelleştirme tespiti için izin vermez T hücreleri ayıklamak için yükünün teknikleri etkinliği olmayan lenfoid doku3Akış Sitometresi için sınırlı.
Biz ve diğerleri peptid yüklü MHC sınıf ı ve sınıf II tetramer veya multimer reaktifler antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücreleri doku4,5,6,7, leke yöntemleri kullanarak geliştirdik 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. bu IST yöntemleri konumunu, bereket ve fenotip antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücre dokularında belirlenmesi için izin ve diğer hücre ve dokularda yapıları göreli bu hücrelerinin tespit etmek için bir yol sağlar. Bizim grup yoğun MHC kullanılan-ben insan immün yetmezlik virüsü (HIV) - ve maymun immün yetmezlik virüsü (SIV) - çalışmaya boyama tetramer lenfoid, genital ve rektal dokularda HIV ve SIV immunopathogenesis anlamak için belirli CD8 T hücreleri ve başarılı stratejileri14,15,16,17ilişkilendirir tanımlamak için. Buna ek olarak, aynı zamanda IST in situ hibridizasyon (ISH yerelleştirilmesine ve virüs özgü CD8 T hücreleri ve hücre bulaştırmak virüs ölçmek için) ile birleştirir bir teknik dokularda ve in vivo efektör hedef düzeylerini belirlemek için geliştirdiğimiz 18 , 19.
Burada, MHC peptid yüklü bir iletişim kuralı'nı tarif-ben tetramers antijen spesifik CD8 T hücreleri, taze doku bölümlerde için counterstain doku IHC kullanarak leke ve belirli doku bölmeleri içinde belirli fenotipleri hücrelerle ölçmek için. Bu bizim son yayında Li hangi biz konumunu, bereket ve fenotip lenfoid doku SIV özgü T hücrelerinin makak20kronik SIV enfeksiyon sırasında tespit ve ark.tarafından kullanılan aynı yordamlardır.
Bu yordam için taze doku kesitli ve gecede peptid yüklü MHC ile inkübe-ben tetramers Birleşik floresein thiocyanate molekülleri (FITC). O zaman paraformaldehyde içinde sabitlenir. Doku düzelttikten sonra MHC tetramers sinyalini tavşan anti-FITC antikorları kullanarak ve daha fazla ilişkili tetramers sinyali yükseltmek fluorescently tagged Anti-tavşan IgG antikorlar ile inkübe güçlendirilmiş. IHC IST ile birlikte antijen spesifik T hücreleri ve çevreleyen hücreleri tanımlamak için kullanılır. Hücre veya hücre dışı alanda yüzeyinde epitopları tanımak antikorlar tetramers ile birincil kuluçka eklenir. Hücre içi epitopları tanımak antikor boyama önce hücre duvarı Permeasyon gerektirir. Lekeli doku bölümleri confocal bir mikroskop kullanarak yansıma ve confocal yazılım kullanılarak analiz. Etiketli hücreleri ImageJ veya confocal mikroskobu yazılım sayılabilir. Açıklanan protokol için hangi MHC antijen spesifik CD8 T hücre herhangi bir doku aslında herhangi bir leke için kullanılabilir-ben tetramers mevcuttur.

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBL6391V</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Razor&amp;nbsp; blade</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather Disposable Scalpel</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Round paintbrush #2</td><td>PRINCETON ART &amp;amp; BRUSH CO.</td><td>4350R</td><td>Can trim as needed with razor</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

T hücreleri gibi algılama ve virüs bulaşan hücreleri ortadan kaldırarak, otoimmüniteye önlenmesi, antikor ve algılama ve kanser hücrelerinin eleme B-hücreli ve plazma hücreli üretimde yardımcı birçok immünolojik işlemlere için önemlidir. Akış Sitometresi tarafından analiz antijen spesifik T hücrelerinin MHC-tetramer boyama geliştirme çalışma ve T hücrelerinin immunobiology anlamak yeteneğimizi devrim yarattı. Son derece yararlı olsa da miktar ve fenotip antijen spesifik T hücreleri belirlemek için Akış Sitometresi antijen spesifik T hücreler diğer hücrelere ve dokulara ve geçerli yükünün teknikleri yapıları kayma lokalizasyonu belirleyemiyor T ayıklamak için hücreleri için Akış Sitometresi etkinliği olmayan lenfoid dokulara sınırlı. Situ MHC-tetramer (IST) Boyama belirli antijenleri dokularda ilgi için T hücreleri görselleştirmek için bir tekniktir. İmmünhistokimya (IHC) ile birlikte, bereket, konumu ve fenotip antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücre dokularında IST belirleyebilirsiniz. Burada, leke ve antijen spesifik CD8 T hücreleri, belirli doku bölmeleri içinde yer alan belirli fenotipleri ile numaralandırmak için bir protokol açıklayın. Bu işlemleri başlıklı Li vdtarafından bizim son yayında kullanılan aynıdır "köklerinin kısmen CD8 tarafından bastırılmış hücrelerde Simian immün yetmezlik virüsü üreten hücreleri+ In Vivo." Çünkü onlar, fenotip, yerelleştirmek için kullanılan ve aslında herhangi bir antijen spesifik CD8 T hücre MHC tetramers herhangi bir doku elde edilebilir ölçmek açıklanan yöntemleri genel olarak geçerlidir.

Şekil 1 confocal görüntüleri confocal mikroskop kullanarak toplamak nasıl gösterir. Şekil 2 sayısal görüntü analizi ImageJ kullanarak gösterir. Şekil 3 ve 4 temsilcisi bir SIV dokulardan lenf nodu görüntülerini MHC tetramers, CD8 antikorlar ve CD20 antikorları ile lekeli rhesus makak enfekte göstermek ve MHC-tetramer boyama özgüllüğü göstermek için hizmet. <strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues at JoVE

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Burada, situ MHC-tetramer boyama immünhistokimya yerelleştirme, fenotip ve dokularda antijen spesifik T hücrelerinin miktarını belirlemek ile bir araya getiren bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı diğer hücre tipi ve dokularda yapıları göreli antijen spesifik CD8 T hücrelerinin kayma ve fenotipik özellikleri belirlemek için kullanılır.

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

12.2K Görüntüleme.  University of Minnesota. Burada, situ MHC-tetramer boyama immünhistokimya yerelleştirme, fenotip ve dokularda antijen spesifik T hücrelerinin miktarını belirlemek ile bir araya getiren bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı diğer hücre tipi ve dokularda yapıları göreli antijen spesifik CD8 T hücrelerinin kayma ve fenotipik özellikleri belirlemek için kullanılır.

Video: In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it is now well established that the immune infiltrate in human tumors can correlate with prognosis and response to therapy. The analysis of the immune infiltrate in the tumor microenvironment has become a major challenge for the classification of patients and the response to treatment.
The co-expression of inhibitory receptors such as Program Cell Death Protein 1 (PD1; also known as CD279), Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Cell Immunoglobulin and Mucin Containing Protein-3 (Tim-3; also known as CD366), and Lymphocyte Activation Gene 3 (Lag-3; also known as CD223), is a hallmark of T cell exhaustion. We developed a multiparametric in situ immunofluorescence staining to identify and quantify at the cellular level the co-expression of these inhibitory receptors. On a retrospective series of frozen tissue of renal cell carcinomas (RCC), using a fluorescence multispectral imaging technology coupled with an image analysis software, it was found that co-expression of PD-1 and Tim-3 on tumor infiltrating CD8+ T cells is correlated with a poor prognosis in RCC. To our knowledge, this represents the first study demonstrating that this automated multiplex in situ technology may have some clinical relevance.

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Studying tumor microenvironment may identify prognostic or predictive biomarkers of clinical response to immunotherapy. Presented here, is an innovative method based on in situ fluorescence multispectral imaging to analyze and count automatically various subpopulations of CD8+ T cells. This reproducible and reliable technique is suitable for large cohort analyses.

Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8 miktar+ T hücreleri

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Kanser Araştırmaları

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Biyoloji

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

Farelerde Tümör Sızan CD8 + T Hücrelerinin Dinamiğini Değerlendirmek için Tümör Transplantasyonu

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

Maymun bağışıklık eksikliği virüsüne özgü CD8 analizi<sup&gt; +</sup&gt; Peptid MHC-I tetramer boyama ile Rhesus macaque maymunlarının T-hücrelerinin

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Fare Akciğerlerinde Antijene Özgü T Hücrelerinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

Yazar Spotlight: Tetramerler Kullanarak Fare Akciğerlerinde Antijene Özgü T Hücrelerini Tespit Etmek için Optimize Edilmiş Protokol

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST