אנו מודים חברי החטיבה למדע הגנום של מעבדה ביולוגיה מערכתית, רפואה, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו. אנו מודים במיוחד ד ר ה Aburatani ד ר טי קודאמה, (LSBM, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו), ד ר ק. Tomizuka, ד ר טי יושידה, ד ר א Kunisato (Kyowa Hakko קירין ושות', בע מ) דיונים מועילים ותמיכה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק הסיוע עבור צעירים מדען (א) (26710005, טי. או), מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (26116711 ו-16 H 01567, טי. או), מענק הסיוע עבור אתגר מחקר גישוש (16K 14605, טי. או) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן, קרן המדע טקדה (טי. או), קרן קוביאשי לחקר הסרטן (טי. או) הפרויקט לחקר הסרטן, האבולוציה טיפולית (P-צור), המחקר המעשי לבקרת סרטן חדשניות של הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED (טי. או).

1. הכנת חומצי תרבות בינוני
<ol><li>
הכנה של שליטה (pH 7.4) ו pH נמוך (pH 6.8) תרבות בינוני
	<ol>
<li>להמיס 4.75 גר' אבקת DMEM בלי-גלוטמין 500 מ ל מים.</li>
		<li>להכין פתרון3 NaHCO 0.33 M בבקבוק לחץ חזק. שים לב: חשוב להשתמש בקבוק לחץ חזק מאז NaHCO3 פולט גז2 CO, כאשר הם מחוממים, תרמית מפורקת.</li>
		<li>אוטוקלב המדיום, פתרון. לאפשר מאגרים אלה להצטנן עד 25 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הוסף 5 מ ל-200 מ מגלוטמין, 5 מ של פניצילין-סטרפטומיצין, ו- 50 מ של העובר סרום שור עד 500 מ"ל של DMEM בלי ביקרבונט.</li>
		<li>שליטה (pH 7.4) בינונית, להוסיף 2.4 מ של 0.33 מ' NaHCO3 פתרון לכל 100 מ של DMEM בלי ביקרבונט. בינוני נמוך-pH (pH 6.8), הוסיפו 0.6 מ"ל של 0.33 מ' NaHCO3 פתרון לכל 100 מ של DMEM בלי ביקרבונט.</li>
		<li>בדוק את ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2. הערה: כמות NaHCO3 פתרון צריכה תיקון בהתאם רמת החומציות בינוני, שיכול להיות שונה בהתאם לתוכן2 CO של החממה, לחץ אוויר. באופן אידיאלי, בפעם הראשונה, עדיף למדוד את רמת ה-pH בינוני עם ריכוזים שונים של ביקרבונט כדי לקבוע את הכמות המתאימה של NaHCO פתרון3 כדי להוסיף DMEM.<ol>
<li>לאסוף את תרבות בינוני מיד לאחר הסרת המנה תרבות החממה2 CO ומדידת רמת ה-pH באמצעות מד pH. לשמור על הטמפרטורה בינוני 37 ° C שימוש באמבט מים במידת הצורך. למדוד את רמת החומציות בינוני שלוש פעמים באופן עצמאי. הערה: NaHCO3 פתרון צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C, צריך להיות מוכן טרי כל מדיה. המוצרים הנמכרים בו ניתן להשתמש במחקר זה מפורטים בטבלה של חומרים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת לקטאט-induced או HCl-induced בינונית תרבות חומצי
	<ol>
<li>להוסיף µL 74 של לקטט פתרון או µL 125 של 1 M HCl 100 מ של שליטה בינונית (להכין בשלב 1.1.5).</li>
		<li>בדוק את ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2. הערה: כמות חומצת החלב או HCl פתרון גם צריך להיות מותאם על פי ה-pH בינוני, שיכול להיות שונה בהתאם לתוכן2 CO חממה, לחץ אוויר. באופן אידיאלי, עדיף למדוד את רמת ה-pH בינוני עם לקטט טורי או HCl ריכוזים כדי לקבוע את הכמות המתאימה עבור התאמת רמת ה-pH הרצוי של המדיום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. קצירת וטיפול בתאי
<ol><li>להתחיל לטפח תאים ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 לפחות שבוע אחד לפני ביצוע ניסויים. הערה: הקווים תא השתמשו במחקר זה מפורטים בטבלה של חומרים.</li>
	<li>מעבר תאים כאשר הם מגיעים confluency 70-90%. אל תאפשר את התאים להפוך confluent. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים בזמן התרגול היומי.</li>
	<li>לשטוף את התאים על-ידי הוספת 5 מ"ל PBS. האחות של PBS ומוסיפים אנזים התולש כגון 1 מ"ל טריפסין.</li>
	<li>דגירה ב 37 ° C עד התאים מעוגלים, נתחיל לנתק.</li>
	<li>הוסף 5 מ של תרבות בינוני על התאים מנותקת, לנטרל אנזים. העברת התליה תא צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה למשך 3 דקות ב x 300 ג' לשאוב תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים תרבות בינונית.</li>
	<li>לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer Trypan-כחול.</li>
	<li>זרע 5.0 x 105 תאים/טוב של מנה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של מדיום. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.</li>
	<li>האחות המדיום תרבות, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל PBS ולהוסיף 10 מ"ל של המדיום תרבות חומצי מוכן בסעיף 1. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.</li>
</ol>3. RNA בידוד
<ol><li>האחות תרבות בינוני ולשטוף תאים עם 5 מ"ל PBS. לשבש את התאים על-ידי הוספת ריאגנט החילוץ RNA (ראה טבלאות של חומרים).</li>
	<li>לגרד את המאכל לזמן קצר, ואז להסיר הכימית החילוץ RNA עם פיפטה, להפקיד את ה-RNA החילוץ ריאגנט תא lysate לתוך צינור 1.5 מ. יוצאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 250 µL כלורופורם, לנער את הצינור נמרצות תעזוב ס' 15 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. ואני צנטריפוגה-≥8, 000 g x עבור 5 דקות.</li>
	<li>הסר בזהירות את פאזה מימית באמצעות פיפטה. להשאיר חלק השלב מימית. מקום אחר צינור 1.5 מ.</li>
	<li>מוסיפים אלכוהול איזופרופיל µL 550 לשלב מימית ומערבבים בעדינות. להשאיר בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צנטריפוגה במהירות מירבית (≥ 20, 000 x g) במשך 20 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>יוצקים את אלכוהול איזופרופיל ולהוסיף מים מטופלים 1 מ"ל אתנול 75% ב- DEPC. מערבבים בעדינות. צנטריפוגה ב 8000 g x במשך 5 דקות.</li>
	<li>פיפטה הנחה אתנול ולתת שכדורי מילה נהדרת.</li>
	<li>להוסיף שמים מטופלים כ- 15-25 µL (בהתאם התשואה) של DEPC כדי בגדר RNA. מערבבים ביסודיות.</li>
	<li>למדוד את הריכוז של RNA מבודדים על ידי מדידת OD-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים.</li>
</ol>4. cDNA סינתזה
<ol><li>שילוב הרכיבים הבאים בשפופרת תגובת ה-PCR: עד 5 µg הכולל RNA, 1 µL Oligo dT (50 מיקרומטר) או ערבוב אקראי פריימר (60 מיקרומטר), 1 dNTP 10 מ מ µL, ומים ללא נוקלאז כדי הנפח הכולל של 14 µL.</li>
	<li>לערבב, בקצרה centrifuge הרכיבים באמצעות צנטריפוגה benchtop קטן (~ 5 s). Denature המדגם RNA/פריימר למשך 5 דקות ב 65 º C. ספין בקצרה (~ 5 s) באמצעות benchtop קטן צנטריפוגה, שים המדגם מיד על קרח לפחות 1 דקות.</li>
	<li>הוסף את המרכיבים הבאים: 4 µL 5 x מאגר שעתוק לאחור, 1 µL רוורס טרנסקריפטאז (200 U/µL), 1 µL RNase מעכב (40 U µL). הערה: דוגמאות ערכות זמינים מסחרית מוצגות בטבלה של חומרים
</li>
	<li>קאפ הצינור, לערבב ולאחר מכן centrifuge בקצרה את תוכן באמצעות צנטריפוגה benchtop קטן (~ 5 s). דגירה תערובת התגובה משולב ב 50-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>בטל את התגובה על ידי המקננת ב 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
</ol>5. מדידה של ביטוי גנים חומצה מגיב באמצעות PCR בזמן אמת
<ol><li>לשלב את המרכיבים הבאים בצלחת תגובה 384-ובכן: 1 µL תבנית cDNA, 0.75 µL 10 N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine X, 0.3 µL 50 מיקרומטר קדימה פריימר, 0.3 µL 50 מיקרומטר הפוך תחל, אנזימים µL 1, µL 2.5 10 x Taq פולימראז מאגר, 2.5 µL dNTP 20 מ מ, 16.65 µL מים. הערה: דוגמה של ערכות זמינים מסחרית מוצגים בטבלה של חומרים. רשימת צבעי יסוד מוצג בטבלה 1. צלחת 96-ובכן התגובה יכול לשמש גם בשלב זה. ניתן להשתמש גם הגששים אחרים (למשל, Taqman בדיקה).</li>
	<li>הגדרת הניסוי ואת התוכנית הבאה של ה-PCR על מערכת ה-PCR בזמן אמת: 50 º C למשך 2 דקות, מחזור 1; 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מחזור 1; 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C עבור 1 דקות, 40 מחזורי; 95 ° C 15 s, מחזור 1; 60 ° C 15 s, מחזור 1; 95 ° C 15 s, מחזור 1.</li>
	<li>מקם את הצלחת המכשיר qPCR. הפעלת התוכנית. הערה: קולטנים Upregulation של גנים מגיב pH MSMO1, INSIG1ו- IDI1 נמדד על ידי רמות החלבון.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

המחבר קונדו הוא עובד של Kyowa Hakko קירין ושות', בע מ

כאן, אנחנו תיאר מערכת תרבות פשוטה pH חומצי, תהליך ההערכה שלו. השילוב בין שלוש שיטות של acidification בינוני, כלומר, ריכוז ביקרבונט מופחתת, לקטט תוספת תוספת HCl, אפשרו לנו לחקור באופן יסודי את מנגנון ה-pH-תגובה וכדי להשוות את התגובה התאית גידול אחרים תנאים microenvironmental כגון הרעבה היפוקסיה או חומר מזין.
המפתח של שיטה זו הוא לקבוע את המתאים ריכוזי ביקרבונט, לקטט, HCl במדיום תרבות. מדידת רמת ה-pH בינוני עם ריכוזים שונים של ביקרבונט בעת ביצוע פעולת שירות זו בפעם הראשונה חשובה לקבוע את הכמות המתאימה של NaHCO3 במדיום. במהלך תהליך זה, יש צורך למדוד את רמת ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2, כמו טמפרטורה ומצב שיווי משקל בינוני של CO2 רבות על ה-pH בינוני. Autoclaving של ביקרבונט מומלץ לעתים קרובות, כמו ביקרבונט בקלות הופך שטוח. צפיפות תא, confluency תא הם גורמים מהותיים כי מספר גדול של תאים סרטניים גדל בקלות acidify של המדיום תרבות אפילו בדגימות שליטה. בנוסף, תגובות ה-pH חומצי חוץ-תאית תלויים התנאי של התאים, ועלול לדהות כמו תאים הם passaged, אז תאים עם פחות מ- 10 קטעים שימשו את הניסויים.
השיטה שלנו באופן משמעותי הפגינו את היציבות של pH בינונית במשך 24 שעות ביממה, לעומת מספר מדיה pH חומצי. פרוטוקול זה, שימשה pH בינונית של 6.8 כמו תנאי pH נמוך, אבל טורי pH חומצי בין pH 6.4 ו 6.9, בנוסף התקשורת הטורית pH בסיסי בין pH 7.4 ו- 8.0, שימשו כדי לחקור את תגובת תאי נגד acidification חוץ-תאית.
התמקדנו בעיקר תאים סרטניים, אך שיטה זו יכולה לשמש עבור סוגים אחרים של תאים בתוך microenvironment הגידול, לרבות תאי סטרומה תאים חיסוניים, תאי אנדותל כלי הדם. אנחנו ואחרים דיווחו כי לפחות חלק מנגנונים רגישים pH בתאים סרטניים נפוצים ב תאים נורמליים7. זה אפשרי גם ליישם שיטה זו לניתוח של ראשי תאים אחרים, כמו גם תאי גזע עובריים, המושרה בתאי גזע pluripotent. מגבלה אחת של מערכת תרבות זו יכולה להיות הקושי של שמירה על התנאי pH חומצי בניסויים לטווח ארוך.
חמצת מזוהה עם סוגים שונים של מחלות. שיטה זו יכולה להיות ישים לא רק בחקר הסרטן אלא גם בלימוד הפרעות חומציים כגון חמצת קטוטית סוכרתית, חמצת אבובית הכליה חמצת נשימתית.

Microenvironment הגידול משחק תפקידים חיוניים ב התקדמות הגידול, סרטן התא חילוף החומרים1,2,3. תאים סרטניים נחשפים לעיתים קרובות תנאים כמו היפוקסיה, מניעת מזון ו pH חומצי חוץ-תאית (pHe). עם זאת, תפקידו של pHe בהתקדמות הגידול יש לא הובהרו בהרחבה כמו הרעבה היפוקסיה או חומר מזין. PHe ברקמת הגידול יכול להיות חומצי, להגיע בערך pH 6.84,5. ה-pH חומצי נובע הפרשה glycolytic ואנאירוביים של פרוטונים (H.+), חומצת החלב על ידי סרטן מתרבים תאים5,6.
מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי היסטון חומצי pHe-induced deacetylation חמצון חומצות שומן, אקסוציטוזה של lysosomes חומצי עבור התאקלמות9,108,7,חמור החומצית. עם זאת, המנגנונים דרך איזה acidification חוץ-תאית משפיעה על התנהגות סרטן והזהות של מפתח הרגולטורים ב microenvironment הגידול pH חומצי לא מלא נקבעו. יתר על כן, מספר דיווחים מתוארת מדיה pH חומצי שונים באמצעות ריכוזים לא ברור של ביקרבונט, מאגר טריס, צינורות, HEPES או לקטאט HCl, אבל ישנם כמה דיווחים להפגין את היציבות של מנוכי עונתיות בינונית ולא מקיף השוואה של מספר ברורים media תרבות חומצי7,8,9,10
התירי את הרגולטורים מפתח ושינויים מטבוליים בתאי סרטן בהקשר של acidification חוץ-תאית, אנחנו הקימה פשוטה in vitro לקשרי תרבות מודל לשמירה על pHe חומצי ובחן את התפקיד של pHe סרטן תאים11. באמצעות שיטה זו, אנו נשמר אמצעי התרבות חומצי עם pHe של 6.8 ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2, באמצעות ריכוז ביקרבונט מופחתת בהמדיום תרבות. pH 7.4 שימש כרגיל ושליטה בינוני. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h במהלך התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. כי גליקוליזה משופרת מאיצה הפרשת לא רק פרוטונים, אלא גם לקטט7,8,9, הקמנו גם שיטה תרבות מחקה חמצת לקטאט-induced על-ידי הוספת חומצת החלב במקום לצמצם ריכוז ביקרבונט. בנוסף, HCl-induced pHe חומצי במדיום מאפשר לנו לשלול את האפשרות כי הסלולר התגובות pH חומצי תרבות בינוני אינם עקב ריכוז מופחתת של ביקרבונט. יתר על כן, באמצעות מדיה שונים עם pH של 6.4-7.4 ריכוז ביקרבונט שונים, שנוכל להעריך את מידת pHe השפעות על תגובות הסלולר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

תנאי microenvironment הגידול, כמו היפוקסיה או מזין רעב, משחק תפקידים חיוניים התקדמות סרטן, גידול ממאיר. עם זאת, התפקיד של pH חומצי חוץ-תאי הגידול תוקפנות, המנגנון הבסיסי שלה לא בהרחבה נחקרה בהשוואה לתנאי רעב ובשפתיים או מזין. בנוסף, שיטה תרבות מוגדרים היטב כדי לחקות את microenvironment חומצי חוץ-תאי הגידול לא מלאה דווחה.
כאן אנו מציגים שיטה תרבות פשוטה במבחנה כדי לשמור על pH חומצי חוץ-תאית באמצעות צמצום ביקרבונט ו לקטט מוגבר או HCl ריכוזים במדיום תרבות. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h בעקבות התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. שלושה תנאים ברורים מדיה חומצי במחקר זה מאוד גנים pH מגיב upregulated כגון MSMO1, INSIG1ו- IDI1 לעומת היפוקסיה או מזין רעב. קולטנים upregulation של גנים אלה יכול לשמש כסמן של pH חומצי. טכניקות פשוטות אלו מועילים התירי מנגנונים הבסיסית של גידול ממאיר תחת microenvironment הגידול חומצי. לכן, מערכת התרבות שלנו pH חומצי חוץ-תאית מאפשרת גילוי של pH חומצי הסלולר תגובות לא רק בתאים סרטניים אלא גם תאים ראשוני, כגון תאים אבובית הכליה, ביחס חומצי הפרעות אחרות כולל, חמצת קטוטית סוכרתית, חמצת לקטית, חמצת אבובית הכליה ו חמצת נשימתית.

כדי לקבוע ריכוז ביקרבונט המתאים, אנו מוכן DMEM בטווח של 0 - 8 מ"מ NaHCO3 (סופי ריכוז במדיום תרבות), הצליח בהכנת תרבות המדיה עם pH החל 6.4-7.4 (איור 1). הכנו DMEM עם 8 מ"מ NaHCO3 (pH 7.4) שליטה בינוני, ו 2 מ מ NaHCO3 (pH 6.8) כמדיום עם pH חומצי לפי הדוח הקודם וקבע כי ה-pH חוץ-תאית מגיע ל- pH 6.8 עבור גידולים מוצקים4,5. ה-pH של המדיום חומצי. הנמשכת במשך 24 שעות ביממה, והוא ירד בהדרגה עד בערך pH 6.6 72 h במהלך התרבות של PANC-1 ו- AsPC-1 תאים (איור 2). הבא, כדי לקבוע את כמות חומצת החלב או HCl נדרש כדי להתאים את המדיום שליטה (pH 7.4) ל pH 6.8, אנו להוסיף כמויות שונות של לקטט או HCl המדיום שליטה למדוד את רמת החומציות של המדיום ואני נמצא כי ה-pH של המדיום שליטה עם מיומנויות ריכ הסופי n של 22.5 מ מ 6.25 HCl ו לקטט מיקרומטר להגיע ערך של 6.8 (איור 3).
ההשפעה של acidification חוץ-תאית באמצעות מדיום עם pH נמוך ניתן בקלות להעריך בהתבסס על קולטנים upregulation של גנים מגיב pH חומצי כגון MSMO1, IDI1ו- INSIG1. ביטוי של גנים אלה היה גדל מאוד תחת pH נמוך בהשוואה שלהם ביטוי תחת היפוקסיה או מזין רעב (איור 4). בנוסף, קולטנים upregulation של גנים אלה לא היה ספציפי למדיום שבו ה-pH חומצי נגרם על ידי רמות ביקרבונט מופחתת, היו גם upregulated על-ידי מדיום שבו pH חומצי נגרם על ידי התוספת של חומצת החלב ו/או HCl (איור 5). השוואה של הסלולר התגובות המדיה שבה ה-pH חומצי נגזרת ברמות ביקרבונט מופחת או התוספת של חומצת החלב או HCl מאפשרת לנו לקבוע אם תגובות הסלולר הן ספציפיות לסוגים מסוימים של acidification. קולטנים Upregulation של הגנים האחראים pH חומצי כגון IDI1, MSMO1, INSIG1 תחת חוץ-תאית pH נמוך מתרחשת גם תאים נורמליים (איור 6), כך שניתן להחיל את השיטה שלנו לא רק תאים סרטניים אלא גם תאים נורמליים. בתנאי pH גבוה, רמת הביטוי של הגנים האחראים-pH לא היה upregulated PANC-1, AsPC-1 תאים (איור 7), אשר יכול לשמש בקרה שלילית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig1.jpg"> איור 1. הקשר בין ריכוז3 NaHCO לבין תואר דוקטורט בינונית הציר האופקי מראה ריכוז של NaHCO3 ואת הציר האנכי מראה pH בינוני ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2- <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig2.jpg"> באיור 2. שינוי pH בינוני בינוני תרבות נמוכה-pH (pH 6.8) במהלך 72 h-תרבות- PH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות ביממה, ירד בהדרגה במשך 72 h במהלך התרבות של תאים PANC-1 ו- AsPC-1. 5.0 x 105 תאים היו חורר מנה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של מדיום, מודגרות במשך 24 שעות ביממה, לשנות ל- pH נמוך תרבות בינוני. הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig3.jpg"> איור 3. מתאם בין לקטאט או ריכוזי HCl ו- pH של המדיום. המדיום שליטה (pH 7.4) היה באגירה מלאה עם ריכוזים שונים של לקטט או HCl. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig4.jpg"> באיור 4. קולטנים upregulation תעתיק של גנים מגיב pH חומצי בתגובה תואר נמוך ברמת הביטוי MSMO1, IDI1, INSIG1 היה גבוה ב PANC-1 ו- AsPC-1 תאים בהקשר של חומציות נמוכה (pH) מאשר תחת היפוקסיה (H) או תנאי רעב מזין (NS) אחרי ה 24 נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. הסטודנט t-בוצעו בדיקות להשוואות המצוין. p < 0.005. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig5.jpg"> איור 5. קולטנים upregulation תעתיק של גנים מגיב pH חומצי בתגובה חמצת לקטית, חמצת בתיווך HCl. הביטוי של mRNAs IDI1, MSMO1ו INSIG1 ב PANC-1 תאים ותאים AsPC-1 נקבע ע י ניתוח כמותי פולימראז בזמן אמת תגובת שרשרת תחת שליטה (קון; pH 7.4), חומציות נמוכה (pH; pH 6.8, צמצום כמות NaHCO3 ), חמצת לקטית (חומצת החלב; pH 6.8, גדלה כמות חומצת החלב), ותנאי בתיווך HCl חמצת (HCl; pH 6.8, גדלה כמות של HCl) עבור ה 24 נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. הסטודנט t-בוצעו בדיקות להשוואות המצוין. p < 0.005. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig6.jpg"> איור 6. קולטנים upregulation תעתיק של גנים מגיב pH חומצי בתגובה pH נמוך של תאים נורמליים. ברמת הביטוי MSMO1, IDI1, INSIG1 upregulated ב fibroblastic ק מ- 6, טיג, תאים MRC9 ותאי אנדותל HUVEC לאחר 24 ח' נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. הסטודנט t-בוצעו בדיקות להשוואות המצוין. p < 0.005. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig7.jpg"> איור 7. רמת ביטוי של גנים אחראים-pH חומצי בתנאי pH גבוה (pH 7.6 ל- 8.0) לשם השוואה תחת pH נמוך (pH 6.8). רמת הביטוי של הגנים האחראים-pH כמו IDI1, MSMO1ו INSIG1 נותרת ללא שינוי בתנאים pH גבוה (pH 7.6 ל- 8.0) ב PANC-1, AsPC-1 תאים לאחר 24 ח' נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פריימר</td>
			<td colspan="2">רצף פריימר לפנים</td>
			<td>פריימר</td>
			<td colspan="2">רצף pimer הפוכה</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB</td>
			<td colspan="2">5'-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3'</td>
			<td>ACTB</td>
			<td colspan="2">5'-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>MSMO1</td>
			<td colspan="2">5'-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3'</td>
			<td>MSMO1</td>
			<td colspan="2">5'-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>INSIG1</td>
			<td colspan="2">5'-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3'</td>
			<td>INSIG1</td>
			<td colspan="2">5'-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>IDI1</td>
			<td colspan="2">5'-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3'</td>
			<td>IDI1</td>
			<td colspan="2">5'-CAACATCCGGCATAACTGTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1- רשימת תחל להשתמש בניתוח ה-PCR כמותי בזמן אמת-

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Microenvironment הגידול חומצי ממלאת תפקידים חיוניים בהתקדמות הגידול. כדי להעריך את ההשפעות של ה-pH חומצי חוץ-תאית על סרטן תאי במבחנה, הקמנו מערכות פשוטות תרבות חומצי.

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

SCIENTISTS IN ACTION

14.5K Views.  Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Microenvironment הגידול חומצי ממלאת תפקידים חיוניים בהתקדמות הגידול. כדי להעריך את ההשפעות של ה-pH חומצי חוץ-תאית על סרטן תאי במבחנה, הקמנו מערכות פשוטות תרבות חומצי.

Video: Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform routine activities, but prosthetic suspensions using traditional socket technology can prove to be cumbersome and uncomfortable for a person with limb loss.  Moreover, for those with high proximal amputations, limited residual limb length may prevent exoprosthesis attachment all together. Osseointegrated implant technology is a novel operative procedure which allows firm skeletal attachment between the host bone and an implant. Preliminary results in European amputees with osseointegrated implants have shown improved clinical outcomes by allowing direct transfer of loads to the bone-implant interface.  Despite the apparent advantages of osseointegration over socket technology, the current rehabilitation procedures require long periods of restrictive load bearing prior which may be reduced with expedited skeletal attachment via electrical stimulation.  The goal of the osseointegrated intelligent implant design (OIID) system is to make the implant part of an electrical system to accelerate skeletal attachment and help prevent periprosthetic infection. To determine optimal electrode size and placement, we initiated proof of concept with computational modeling of the electric fields and current densities that arise during electrical stimulation of amputee residual limbs.  In order to provide insure patient safety, subjects with retrospective computed tomography scans were selected and three dimensional reconstructions were created using customized software programs to ensure anatomical accuracy (Seg3D and SCIRun) in an IRB and HIPAA approved study.  These software packages supported the development of patient specific models and allowed for interactive manipulation of electrode position and size. Preliminary results indicate that electric fields and current densities can be generated at the implant interface to achieve the homogenous electric field distributions   required to induce osteoblast migration, enhance skeletal fixation and may help prevent periprosthetic infections.  Based on the electrode configurations experimented with in the model, an external two band configuration will be advocated in the future.

There is a need to develop alternative prosthesis attachment due to limb loss attributed to vascular occlusive diseases and trauma. The goal of the work is to introduce an osseointegrated intelligent implant design system to increase skeletal fixation and reduce periprosthetic infection rates for patients needing osseointegrated technology.

ניתוח Bioelectric של מערכת Osseointegrated שתל Intelligent Design עבור קטועי גפיים

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The plant hormone auxin rapidly stimulates cell elongation in young stems and similar tissues at least in part by an acid-growth mechanism 2, 3. Auxin activates a H+ pump in the plasma membrane, causing acidification of the cell wall solution. Wall acidification activates expansins, which are endogenous cell wall-loosening proteins 4, causing the cell wall to yield to the wall tensions created by cell turgor pressure. As a result, the cell begins to enlarge rapidly. This 'acid growth' phenomenon is readily measured in isolated (nonliving) cell wall specimens. The ability of cell walls to undergo acid-induced extension is not simply the result of the structural arrangement of the cell wall polysaccharides (e.g. pectins), but depends on the activity of expansins 5. Expansins do not have any known enzymatic activity and the only way to assay for expansin activity is to measure their induction of cell wall extension. This video report details the sources and preparation techniques for obtaining suitable wall materials for expansin assays and goes on to show acid-induced extension and expansin-induced extension of wall samples prepared from growing cucumber hypocotyls.
 To obtain suitable cell wall samples, cucumber seedlings are grown in the dark, the hypocotyls are cut and frozen at -80 &deg;C. Frozen hypocotyls are abraded, flattened, and then clamped at constant tension in a special cuvette for extensometer measurements. To measure acid-induced extension, the walls are initially buffered at neutral pH, resulting in low activity of expansins that are components of the native cell walls. Upon buffer exchange to acidic pH, expansins are activated and the cell walls extend rapidly. We also demonstrate expansin activity in a reconstitution assay. For this part, we use a brief heat treatment to denature the native expansins in the cell wall samples. These inactivated cell walls do not extend even in acidic buffer, but addition of expansins to the cell walls rapidly restores their ability to extend.

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

We demonstrate the use of a constant-force extensometer to measure long-term extension (creep) of plant cell wall specimens induced by acidic buffers and expansin protein.

מדידת תא הצמח החומה הרחבה (Creep) מושרה על ידי ה-pH חומצי על ידי Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

הקמתה של תרבות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו Conjugating

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence in real time has been established without the need to count cells in single cell suspension to avoid any growth perturbation. A high-content image analysis system was used to assess iPCS confluence on 4 different ECMs over time in an automated manner. Different analysis settings were used to assess cell confluence of adherent iPSCs and only a slight difference (at 24 and 48 hours with laminin) has been observed whether a 60, 80 or 100% mask was applied. We also show that laminin lead to the best confluence compared to Matrigel, vitronectin and fibronectin.

The goal of the protocol is to compare different extracellular matrix (ECM) coating conditions to assess how differential coating affects the growth rate of induced pluripotent stem cells (iPSCs). In particular, we aim to set up conditions to obtain optimal growth of iPSC cultures.

מדידת המפגש של iPSCs באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls and restrict access to the brain parenchyma. However, with the development of nanotechnologies, large panels of new nanomaterials were developed to improve drug delivery, highlighting the need for reliable in vitro microsystems to predict brain penetration in the frame of preclinical assays. Here is a straightforward method to set up a microphysiological system to model the BBB using solely human cells. In its configuration, the model consists of a triple culture including brain-like endothelial cells (BLECs), pericytes, and astrocytes, the three main BBB cellular actors necessary to induce and regulate the BBB properties in a more physiological manner without the requirement of tightening compounds. The model developed in a 12-well plate format, ready after 6 days of triple culture, is characterized in physical properties, gene, and protein expressions and used for polymeric nanogel transport measurement. The model can be used for an extensive range of experiments in healthy and pathological conditions and represents a valuable tool for preclinical assessments of molecule and particle transport, as well as inter-and intracellular trafficking.

This protocol describes a method to establish a human blood-brain barrier (BBB) in vitro model. The endothelial cells and pericytes are seeded on each side of an insert filter (blood compartment), and astrocytes are seeded in the bottom well (brain compartment). The model characterized was used for nanoparticles transport experiments.

מערכת תאי תרבית משולשת המדגימה את מחסום הדם-מוח האנושי

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture method to obtain a sufficient number of LG stem cells (LGSCs) is one obstacle for further research and application. The three-dimensional (3D), serum-free culture method for adult mouse LGSCs is well established and shown here. The LGSCs could be continuously passaged and induced to differentiate to acinar or ductal-like cells.
For the LGSC primary culture, the LGs from 6-8-week-old mice were digested with dispase, collagenase I, and trypsin-EDTA. A total of 1 &#215; 104 single cells were seeded into 80 &#181;L of matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in each well of a 24-well plate, precoated with 20 &#181;L of matrix gel-LGSCM matrix. The mix was solidified after incubation for 20 min at 37 &#176;C, and 600 &#181;L of LGSCM added.
For LGSC maintenance, LGSCs cultured for 7 days were disaggregated into single cells by dispase and trypsin-EDTA. The single cells were implanted and cultured according to the method used in the LGSC primary culture. LGSCs could be passaged over 40 times and continuously express stem/progenitor cell markers Krt14, Krt5, P63, and nestin. LGSCs cultured in LGSCM have self-renewal capacity and can differentiate into acinar or ductal-like cells in vitro and in vivo.

The three-dimensional, serum-free culture method for adult lacrimal gland (LG) stem cells is well established for the induction of LG organoid formation and differentiation into acinar or ductal-like cells.

מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...