אנו מודים חברי החטיבה למדע הגנום של מעבדה ביולוגיה מערכתית, רפואה, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו. אנו מודים במיוחד ד ר ה Aburatani ד ר טי קודאמה, (LSBM, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו), ד ר ק. Tomizuka, ד ר טי יושידה, ד ר א Kunisato (Kyowa Hakko קירין ושות', בע מ) דיונים מועילים ותמיכה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק הסיוע עבור צעירים מדען (א) (26710005, טי. או), מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (26116711 ו-16 H 01567, טי. או), מענק הסיוע עבור אתגר מחקר גישוש (16K 14605, טי. או) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן, קרן המדע טקדה (טי. או), קרן קוביאשי לחקר הסרטן (טי. או) הפרויקט לחקר הסרטן, האבולוציה טיפולית (P-צור), המחקר המעשי לבקרת סרטן חדשניות של הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED (טי. או).

1. הכנת חומצי תרבות בינוני
<ol><li>
הכנה של שליטה (pH 7.4) ו pH נמוך (pH 6.8) תרבות בינוני
	<ol>
<li>להמיס 4.75 גר' אבקת DMEM בלי-גלוטמין 500 מ ל מים.</li>
		<li>להכין פתרון3 NaHCO 0.33 M בבקבוק לחץ חזק. שים לב: חשוב להשתמש בקבוק לחץ חזק מאז NaHCO3 פולט גז2 CO, כאשר הם מחוממים, תרמית מפורקת.</li>
		<li>אוטוקלב המדיום, פתרון. לאפשר מאגרים אלה להצטנן עד 25 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הוסף 5 מ ל-200 מ מגלוטמין, 5 מ של פניצילין-סטרפטומיצין, ו- 50 מ של העובר סרום שור עד 500 מ"ל של DMEM בלי ביקרבונט.</li>
		<li>שליטה (pH 7.4) בינונית, להוסיף 2.4 מ של 0.33 מ' NaHCO3 פתרון לכל 100 מ של DMEM בלי ביקרבונט. בינוני נמוך-pH (pH 6.8), הוסיפו 0.6 מ"ל של 0.33 מ' NaHCO3 פתרון לכל 100 מ של DMEM בלי ביקרבונט.</li>
		<li>בדוק את ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2. הערה: כמות NaHCO3 פתרון צריכה תיקון בהתאם רמת החומציות בינוני, שיכול להיות שונה בהתאם לתוכן2 CO של החממה, לחץ אוויר. באופן אידיאלי, בפעם הראשונה, עדיף למדוד את רמת ה-pH בינוני עם ריכוזים שונים של ביקרבונט כדי לקבוע את הכמות המתאימה של NaHCO פתרון3 כדי להוסיף DMEM.<ol>
<li>לאסוף את תרבות בינוני מיד לאחר הסרת המנה תרבות החממה2 CO ומדידת רמת ה-pH באמצעות מד pH. לשמור על הטמפרטורה בינוני 37 ° C שימוש באמבט מים במידת הצורך. למדוד את רמת החומציות בינוני שלוש פעמים באופן עצמאי. הערה: NaHCO3 פתרון צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C, צריך להיות מוכן טרי כל מדיה. המוצרים הנמכרים בו ניתן להשתמש במחקר זה מפורטים בטבלה של חומרים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת לקטאט-induced או HCl-induced בינונית תרבות חומצי
	<ol>
<li>להוסיף µL 74 של לקטט פתרון או µL 125 של 1 M HCl 100 מ של שליטה בינונית (להכין בשלב 1.1.5).</li>
		<li>בדוק את ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2. הערה: כמות חומצת החלב או HCl פתרון גם צריך להיות מותאם על פי ה-pH בינוני, שיכול להיות שונה בהתאם לתוכן2 CO חממה, לחץ אוויר. באופן אידיאלי, עדיף למדוד את רמת ה-pH בינוני עם לקטט טורי או HCl ריכוזים כדי לקבוע את הכמות המתאימה עבור התאמת רמת ה-pH הרצוי של המדיום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. קצירת וטיפול בתאי
<ol><li>להתחיל לטפח תאים ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 לפחות שבוע אחד לפני ביצוע ניסויים. הערה: הקווים תא השתמשו במחקר זה מפורטים בטבלה של חומרים.</li>
	<li>מעבר תאים כאשר הם מגיעים confluency 70-90%. אל תאפשר את התאים להפוך confluent. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים בזמן התרגול היומי.</li>
	<li>לשטוף את התאים על-ידי הוספת 5 מ"ל PBS. האחות של PBS ומוסיפים אנזים התולש כגון 1 מ"ל טריפסין.</li>
	<li>דגירה ב 37 ° C עד התאים מעוגלים, נתחיל לנתק.</li>
	<li>הוסף 5 מ של תרבות בינוני על התאים מנותקת, לנטרל אנזים. העברת התליה תא צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה למשך 3 דקות ב x 300 ג' לשאוב תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים תרבות בינונית.</li>
	<li>לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer Trypan-כחול.</li>
	<li>זרע 5.0 x 105 תאים/טוב של מנה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של מדיום. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.</li>
	<li>האחות המדיום תרבות, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל PBS ולהוסיף 10 מ"ל של המדיום תרבות חומצי מוכן בסעיף 1. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.</li>
</ol>3. RNA בידוד
<ol><li>האחות תרבות בינוני ולשטוף תאים עם 5 מ"ל PBS. לשבש את התאים על-ידי הוספת ריאגנט החילוץ RNA (ראה טבלאות של חומרים).</li>
	<li>לגרד את המאכל לזמן קצר, ואז להסיר הכימית החילוץ RNA עם פיפטה, להפקיד את ה-RNA החילוץ ריאגנט תא lysate לתוך צינור 1.5 מ. יוצאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 250 µL כלורופורם, לנער את הצינור נמרצות תעזוב ס' 15 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. ואני צנטריפוגה-≥8, 000 g x עבור 5 דקות.</li>
	<li>הסר בזהירות את פאזה מימית באמצעות פיפטה. להשאיר חלק השלב מימית. מקום אחר צינור 1.5 מ.</li>
	<li>מוסיפים אלכוהול איזופרופיל µL 550 לשלב מימית ומערבבים בעדינות. להשאיר בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צנטריפוגה במהירות מירבית (≥ 20, 000 x g) במשך 20 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>יוצקים את אלכוהול איזופרופיל ולהוסיף מים מטופלים 1 מ"ל אתנול 75% ב- DEPC. מערבבים בעדינות. צנטריפוגה ב 8000 g x במשך 5 דקות.</li>
	<li>פיפטה הנחה אתנול ולתת שכדורי מילה נהדרת.</li>
	<li>להוסיף שמים מטופלים כ- 15-25 µL (בהתאם התשואה) של DEPC כדי בגדר RNA. מערבבים ביסודיות.</li>
	<li>למדוד את הריכוז של RNA מבודדים על ידי מדידת OD-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים.</li>
</ol>4. cDNA סינתזה
<ol><li>שילוב הרכיבים הבאים בשפופרת תגובת ה-PCR: עד 5 µg הכולל RNA, 1 µL Oligo dT (50 מיקרומטר) או ערבוב אקראי פריימר (60 מיקרומטר), 1 dNTP 10 מ מ µL, ומים ללא נוקלאז כדי הנפח הכולל של 14 µL.</li>
	<li>לערבב, בקצרה centrifuge הרכיבים באמצעות צנטריפוגה benchtop קטן (~ 5 s). Denature המדגם RNA/פריימר למשך 5 דקות ב 65 º C. ספין בקצרה (~ 5 s) באמצעות benchtop קטן צנטריפוגה, שים המדגם מיד על קרח לפחות 1 דקות.</li>
	<li>הוסף את המרכיבים הבאים: 4 µL 5 x מאגר שעתוק לאחור, 1 µL רוורס טרנסקריפטאז (200 U/µL), 1 µL RNase מעכב (40 U µL). הערה: דוגמאות ערכות זמינים מסחרית מוצגות בטבלה של חומרים
</li>
	<li>קאפ הצינור, לערבב ולאחר מכן centrifuge בקצרה את תוכן באמצעות צנטריפוגה benchtop קטן (~ 5 s). דגירה תערובת התגובה משולב ב 50-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>בטל את התגובה על ידי המקננת ב 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
</ol>5. מדידה של ביטוי גנים חומצה מגיב באמצעות PCR בזמן אמת
<ol><li>לשלב את המרכיבים הבאים בצלחת תגובה 384-ובכן: 1 µL תבנית cDNA, 0.75 µL 10 N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine X, 0.3 µL 50 מיקרומטר קדימה פריימר, 0.3 µL 50 מיקרומטר הפוך תחל, אנזימים µL 1, µL 2.5 10 x Taq פולימראז מאגר, 2.5 µL dNTP 20 מ מ, 16.65 µL מים. הערה: דוגמה של ערכות זמינים מסחרית מוצגים בטבלה של חומרים. רשימת צבעי יסוד מוצג בטבלה 1. צלחת 96-ובכן התגובה יכול לשמש גם בשלב זה. ניתן להשתמש גם הגששים אחרים (למשל, Taqman בדיקה).</li>
	<li>הגדרת הניסוי ואת התוכנית הבאה של ה-PCR על מערכת ה-PCR בזמן אמת: 50 º C למשך 2 דקות, מחזור 1; 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מחזור 1; 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C עבור 1 דקות, 40 מחזורי; 95 ° C 15 s, מחזור 1; 60 ° C 15 s, מחזור 1; 95 ° C 15 s, מחזור 1.</li>
	<li>מקם את הצלחת המכשיר qPCR. הפעלת התוכנית. הערה: קולטנים Upregulation של גנים מגיב pH MSMO1, INSIG1ו- IDI1 נמדד על ידי רמות החלבון.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

המחבר קונדו הוא עובד של Kyowa Hakko קירין ושות', בע מ

כאן, אנחנו תיאר מערכת תרבות פשוטה pH חומצי, תהליך ההערכה שלו. השילוב בין שלוש שיטות של acidification בינוני, כלומר, ריכוז ביקרבונט מופחתת, לקטט תוספת תוספת HCl, אפשרו לנו לחקור באופן יסודי את מנגנון ה-pH-תגובה וכדי להשוות את התגובה התאית גידול אחרים תנאים microenvironmental כגון הרעבה היפוקסיה או חומר מזין.
המפתח של שיטה זו הוא לקבוע את המתאים ריכוזי ביקרבונט, לקטט, HCl במדיום תרבות. מדידת רמת ה-pH בינוני עם ריכוזים שונים של ביקרבונט בעת ביצוע פעולת שירות זו בפעם הראשונה חשובה לקבוע את הכמות המתאימה של NaHCO3 במדיום. במהלך תהליך זה, יש צורך למדוד את רמת ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2, כמו טמפרטורה ומצב שיווי משקל בינוני של CO2 רבות על ה-pH בינוני. Autoclaving של ביקרבונט מומלץ לעתים קרובות, כמו ביקרבונט בקלות הופך שטוח. צפיפות תא, confluency תא הם גורמים מהותיים כי מספר גדול של תאים סרטניים גדל בקלות acidify של המדיום תרבות אפילו בדגימות שליטה. בנוסף, תגובות ה-pH חומצי חוץ-תאית תלויים התנאי של התאים, ועלול לדהות כמו תאים הם passaged, אז תאים עם פחות מ- 10 קטעים שימשו את הניסויים.
השיטה שלנו באופן משמעותי הפגינו את היציבות של pH בינונית במשך 24 שעות ביממה, לעומת מספר מדיה pH חומצי. פרוטוקול זה, שימשה pH בינונית של 6.8 כמו תנאי pH נמוך, אבל טורי pH חומצי בין pH 6.4 ו 6.9, בנוסף התקשורת הטורית pH בסיסי בין pH 7.4 ו- 8.0, שימשו כדי לחקור את תגובת תאי נגד acidification חוץ-תאית.
התמקדנו בעיקר תאים סרטניים, אך שיטה זו יכולה לשמש עבור סוגים אחרים של תאים בתוך microenvironment הגידול, לרבות תאי סטרומה תאים חיסוניים, תאי אנדותל כלי הדם. אנחנו ואחרים דיווחו כי לפחות חלק מנגנונים רגישים pH בתאים סרטניים נפוצים ב תאים נורמליים7. זה אפשרי גם ליישם שיטה זו לניתוח של ראשי תאים אחרים, כמו גם תאי גזע עובריים, המושרה בתאי גזע pluripotent. מגבלה אחת של מערכת תרבות זו יכולה להיות הקושי של שמירה על התנאי pH חומצי בניסויים לטווח ארוך.
חמצת מזוהה עם סוגים שונים של מחלות. שיטה זו יכולה להיות ישים לא רק בחקר הסרטן אלא גם בלימוד הפרעות חומציים כגון חמצת קטוטית סוכרתית, חמצת אבובית הכליה חמצת נשימתית.

Microenvironment הגידול משחק תפקידים חיוניים ב התקדמות הגידול, סרטן התא חילוף החומרים1,2,3. תאים סרטניים נחשפים לעיתים קרובות תנאים כמו היפוקסיה, מניעת מזון ו pH חומצי חוץ-תאית (pHe). עם זאת, תפקידו של pHe בהתקדמות הגידול יש לא הובהרו בהרחבה כמו הרעבה היפוקסיה או חומר מזין. PHe ברקמת הגידול יכול להיות חומצי, להגיע בערך pH 6.84,5. ה-pH חומצי נובע הפרשה glycolytic ואנאירוביים של פרוטונים (H.+), חומצת החלב על ידי סרטן מתרבים תאים5,6.
מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי היסטון חומצי pHe-induced deacetylation חמצון חומצות שומן, אקסוציטוזה של lysosomes חומצי עבור התאקלמות9,108,7,חמור החומצית. עם זאת, המנגנונים דרך איזה acidification חוץ-תאית משפיעה על התנהגות סרטן והזהות של מפתח הרגולטורים ב microenvironment הגידול pH חומצי לא מלא נקבעו. יתר על כן, מספר דיווחים מתוארת מדיה pH חומצי שונים באמצעות ריכוזים לא ברור של ביקרבונט, מאגר טריס, צינורות, HEPES או לקטאט HCl, אבל ישנם כמה דיווחים להפגין את היציבות של מנוכי עונתיות בינונית ולא מקיף השוואה של מספר ברורים media תרבות חומצי7,8,9,10
התירי את הרגולטורים מפתח ושינויים מטבוליים בתאי סרטן בהקשר של acidification חוץ-תאית, אנחנו הקימה פשוטה in vitro לקשרי תרבות מודל לשמירה על pHe חומצי ובחן את התפקיד של pHe סרטן תאים11. באמצעות שיטה זו, אנו נשמר אמצעי התרבות חומצי עם pHe של 6.8 ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2, באמצעות ריכוז ביקרבונט מופחתת בהמדיום תרבות. pH 7.4 שימש כרגיל ושליטה בינוני. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h במהלך התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. כי גליקוליזה משופרת מאיצה הפרשת לא רק פרוטונים, אלא גם לקטט7,8,9, הקמנו גם שיטה תרבות מחקה חמצת לקטאט-induced על-ידי הוספת חומצת החלב במקום לצמצם ריכוז ביקרבונט. בנוסף, HCl-induced pHe חומצי במדיום מאפשר לנו לשלול את האפשרות כי הסלולר התגובות pH חומצי תרבות בינוני אינם עקב ריכוז מופחתת של ביקרבונט. יתר על כן, באמצעות מדיה שונים עם pH של 6.4-7.4 ריכוז ביקרבונט שונים, שנוכל להעריך את מידת pHe השפעות על תגובות הסלולר.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium&amp;ldquo;Nissui&amp;rdquo; 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td><td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>Lactic acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368702&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell lines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0432</td><td></td></tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Cell Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

תנאי microenvironment הגידול, כמו היפוקסיה או מזין רעב, משחק תפקידים חיוניים התקדמות סרטן, גידול ממאיר. עם זאת, התפקיד של pH חומצי חוץ-תאי הגידול תוקפנות, המנגנון הבסיסי שלה לא בהרחבה נחקרה בהשוואה לתנאי רעב ובשפתיים או מזין. בנוסף, שיטה תרבות מוגדרים היטב כדי לחקות את microenvironment חומצי חוץ-תאי הגידול לא מלאה דווחה.
כאן אנו מציגים שיטה תרבות פשוטה במבחנה כדי לשמור על pH חומצי חוץ-תאית באמצעות צמצום ביקרבונט ו לקטט מוגבר או HCl ריכוזים במדיום תרבות. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h בעקבות התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. שלושה תנאים ברורים מדיה חומצי במחקר זה מאוד גנים pH מגיב upregulated כגון MSMO1, INSIG1ו- IDI1 לעומת היפוקסיה או מזין רעב. קולטנים upregulation של גנים אלה יכול לשמש כסמן של pH חומצי. טכניקות פשוטות אלו מועילים התירי מנגנונים הבסיסית של גידול ממאיר תחת microenvironment הגידול חומצי. לכן, מערכת התרבות שלנו pH חומצי חוץ-תאית מאפשרת גילוי של pH חומצי הסלולר תגובות לא רק בתאים סרטניים אלא גם תאים ראשוני, כגון תאים אבובית הכליה, ביחס חומצי הפרעות אחרות כולל, חמצת קטוטית סוכרתית, חמצת לקטית, חמצת אבובית הכליה ו חמצת נשימתית.

כדי לקבוע ריכוז ביקרבונט המתאים, אנו מוכן DMEM בטווח של 0 - 8 מ"מ NaHCO3 (סופי ריכוז במדיום תרבות), הצליח בהכנת תרבות המדיה עם pH החל 6.4-7.4 (איור 1). הכנו DMEM עם 8 מ"מ NaHCO3 (pH 7.4) שליטה בינוני, ו 2 מ מ NaHCO3 (pH 6.8) כמדיום עם pH חומצי לפי הדוח הקודם וקבע כי ה-pH חוץ-תאית מגיע ל- pH 6.8 עבור גידולים מוצקים4,5. ה-pH של המדיום חומצי. הנמשכת במשך 24 שעות ביממה, והוא ירד בהדרגה עד בערך pH 6.6 72 h במהלך התרבות של PANC-1 ו- AsPC-1 תאים (איור 2). הבא, כדי לקבוע את כמות חומצת החלב או HCl נדרש כדי להתאים את המדיום שליטה (pH 7.4) ל pH 6.8, אנו להוסיף כמויות שונות של לקטט או HCl המדיום שליטה למדוד את רמת החומציות של המדיום ואני נמצא כי ה-pH של המדיום שליטה עם מיומנויות ריכ הסופי n של 22.5 מ מ 6.25 HCl ו לקטט מיקרומטר להגיע ערך של 6.8 (איור 3).
ההשפעה של acidification חוץ-תאית באמצעות מדיום עם pH נמוך ניתן בקלות להעריך בהתבסס על קולטנים upregulation של גנים מגיב pH חומצי כגון MSMO1, IDI1ו- INSIG1. ביטוי של גנים אלה היה גדל מאוד תחת pH נמוך בהשוואה שלהם ביטוי תחת היפוקסיה או מזין רעב (איור 4). בנוסף, קולטנים upregulation של גנים אלה לא היה ספציפי למדיום שבו ה-pH חומצי נגרם על ידי רמות ביקרבונט מופחתת, היו גם upregulated על-ידי מדיום שבו pH חומצי נגרם על ידי התוספת של חומצת החלב ו/או HCl (איור 5). השוואה של הסלולר התגובות המדיה שבה ה-pH חומצי נגזרת ברמות ביקרבונט מופחת או התוספת של חומצת החלב או HCl מאפשרת לנו לקבוע אם תגובות הסלולר הן ספציפיות לסוגים מסוימים של acidification. קולטנים Upregulation של הגנים האחראים pH חומצי כגון IDI1, MSMO1, INSIG1 תחת חוץ-תאית pH נמוך מתרחשת גם תאים נורמליים (איור 6), כך שניתן להחיל את השיטה שלנו לא רק תאים סרטניים אלא גם תאים נורמליים. בתנאי pH גבוה, רמת הביטוי של הגנים האחראים-pH לא היה upregulated PANC-1, AsPC-1 תאים (איור 7), אשר יכול לשמש בקרה שלילית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig1.jpg"> איור 1. הקשר בין ריכוז3 NaHCO לבין תואר דוקטורט בינונית הציר האופקי מראה ריכוז של NaHCO3 ואת הציר האנכי מראה pH בינוני ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2- <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig2.jpg"> באיור 2. שינוי pH בינוני בינוני תרבות נמוכה-pH (pH 6.8) במהלך 72 h-תרבות- PH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות ביממה, ירד בהדרגה במשך 72 h במהלך התרבות של תאים PANC-1 ו- AsPC-1. 5.0 x 105 תאים היו חורר מנה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של מדיום, מודגרות במשך 24 שעות ביממה, לשנות ל- pH נמוך תרבות בינוני. הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig3.jpg"> איור 3. מתאם בין לקטאט או ריכוזי HCl ו- pH של המדיום. המדיום שליטה (pH 7.4) היה באגירה מלאה עם ריכוזים שונים של לקטט או HCl. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig4.jpg"> באיור 4. קולטנים upregulation תעתיק של גנים מגיב pH חומצי בתגובה תואר נמוך ברמת הביטוי MSMO1, IDI1, INSIG1 היה גבוה ב PANC-1 ו- AsPC-1 תאים בהקשר של חומציות נמוכה (pH) מאשר תחת היפוקסיה (H) או תנאי רעב מזין (NS) אחרי ה 24 נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. הסטודנט t-בוצעו בדיקות להשוואות המצוין. p < 0.005. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig5.jpg"> איור 5. קולטנים upregulation תעתיק של גנים מגיב pH חומצי בתגובה חמצת לקטית, חמצת בתיווך HCl. הביטוי של mRNAs IDI1, MSMO1ו INSIG1 ב PANC-1 תאים ותאים AsPC-1 נקבע ע י ניתוח כמותי פולימראז בזמן אמת תגובת שרשרת תחת שליטה (קון; pH 7.4), חומציות נמוכה (pH; pH 6.8, צמצום כמות NaHCO3 ), חמצת לקטית (חומצת החלב; pH 6.8, גדלה כמות חומצת החלב), ותנאי בתיווך HCl חמצת (HCl; pH 6.8, גדלה כמות של HCl) עבור ה 24 נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. הסטודנט t-בוצעו בדיקות להשוואות המצוין. p < 0.005. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig6.jpg"> איור 6. קולטנים upregulation תעתיק של גנים מגיב pH חומצי בתגובה pH נמוך של תאים נורמליים. ברמת הביטוי MSMO1, IDI1, INSIG1 upregulated ב fibroblastic ק מ- 6, טיג, תאים MRC9 ותאי אנדותל HUVEC לאחר 24 ח' נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. הסטודנט t-בוצעו בדיקות להשוואות המצוין. p < 0.005. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56660/56660fig7.jpg"> איור 7. רמת ביטוי של גנים אחראים-pH חומצי בתנאי pH גבוה (pH 7.6 ל- 8.0) לשם השוואה תחת pH נמוך (pH 6.8). רמת הביטוי של הגנים האחראים-pH כמו IDI1, MSMO1ו INSIG1 נותרת ללא שינוי בתנאים pH גבוה (pH 7.6 ל- 8.0) ב PANC-1, AsPC-1 תאים לאחר 24 ח' נתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SEM לפחות שלושה ניסויים עצמאית. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56660/56660fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פריימר</td>
			<td colspan="2">רצף פריימר לפנים</td>
			<td>פריימר</td>
			<td colspan="2">רצף pimer הפוכה</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB</td>
			<td colspan="2">5'-AGAAGGAGATCACTGCCCTGGCACC-3'</td>
			<td>ACTB</td>
			<td colspan="2">5'-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>MSMO1</td>
			<td colspan="2">5'-ATCATGAGTTTCAGGCTCCATT-3'</td>
			<td>MSMO1</td>
			<td colspan="2">5'-AAGCACGATTCCAATGAAAAAT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>INSIG1</td>
			<td colspan="2">5'-TGGCAGCTTCCCAAGTATTC-3'</td>
			<td>INSIG1</td>
			<td colspan="2">5'-ACTGCGGGTTGGTAATTGAG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>IDI1</td>
			<td colspan="2">5'-TGGATAAAACCCCTGTGGTG-3'</td>
			<td>IDI1</td>
			<td colspan="2">5'-CAACATCCGGCATAACTGTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1- רשימת תחל להשתמש בניתוח ה-PCR כמותי בזמן אמת-

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Microenvironment הגידול חומצי ממלאת תפקידים חיוניים בהתקדמות הגידול. כדי להעריך את ההשפעות של ה-pH חומצי חוץ-תאית על סרטן תאי במבחנה, הקמנו מערכות פשוטות תרבות חומצי.

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

SCIENTISTS IN ACTION

14.6K Views.  Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Microenvironment הגידול חומצי ממלאת תפקידים חיוניים בהתקדמות הגידול. כדי להעריך את ההשפעות של ה-pH חומצי חוץ-תאית על סרטן תאי במבחנה, הקמנו מערכות פשוטות תרבות חומצי.

Video: Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Biochemistry

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

<meta charset="utf8"></head><body>ניטור חוץ תאי של pH חוץ-תאי בזמן אמת

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

במבחנה ניטור pH חוץ-תאי בזמן אמת

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

<meta charset="utf8"></head><body>ניתוח כרונואמפרומטריה של EET ב Lactiplantibacillus plantarum עם DHNA

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron acceptor. This electron acceptor can be an electrode and electrons can be delivered indirectly via a redox-active mediator molecule. Here, we present a protocol to study mediated EET in Lactiplantibacillus plantarum, a probiotic lactic acid bacterium widely used in the food industry, using a bioelectrochemical system. We detail how to assemble a three-electrode, two-chambered bioelectrochemical system and provide guidance on characterizing EET in the presence of a soluble mediator using chronoamperometry and cyclic voltammetry techniques. We use representative data from 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)-mediated EET experiments with L. plantarum to demonstrate data analysis and interpretation. The techniques described in this protocol can open new opportunities for electro-fermentation and bioelectrocatalysis. Recent applications of this electrochemical technique with L. plantarum demonstrated an acceleration of metabolic flux towards producing fermentation end-products, which are critical flavor components in food fermentation. As such, this system has the potential to be further developed to alter flavors in food production or produce valuable chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>אפיון מעבר אלקטרונים חוץ-תאי מתווך בחיידקי חומצה לקטית עם מערכת ביואלקטרוכימית תלת-אלקטרודתית דו-תאית

Here we present a protocol for characterizing mediated extracellular electron transfer (EET) in lactic acid bacteria using a three-electrode, two-chamber bioelectrochemical system. We illustrate this method with Lactiplantibacillus plantarum and the redox mediator 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid and provide a thorough description of the electrochemical techniques used to evaluate mediated EET.

אפיון מעבר אלקטרונים חוץ-תאי מתווך בחיידקי חומצה לקטית עם מערכת ביואלקטרוכימית תלת-אלקטרודתית דו-תאית

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its complex nature, and its diverse association with mammalian components. The goal of this protocol is to culture the gut microbiota in vitro, which allows for the study of the gut microbiota dynamics, without having to consider the contribution of the mammalian milieu. Using in vitro culturing technology, the physiological conditions of the gastro intestinal tract are simulated, including parameters such as pH, temperature, anaerobiosis, and transit time. The intestinal surface of the colon is simulated by adding mucin-coated carriers, creating a mucosal phase, and adding further dimension. The gut microbiota is introduced by inoculating with the human fecal material. Upon inoculation with this complex mixture of bacteria, specific microbes are enriched in the different longitudinal (ascending, transverse and descending colons) and transversal (luminal and mucosal) environments of the in vitro model. It is crucial to allow the system to reach a steady state, in which the community and the metabolites produced remain stable. The experimental results in this manuscript demonstrate how the inoculated gut microbiota community develops into a stable community over time. Once steady state is achieved, the system can be used to analyze bacterial interactions and community functions or to test the effects of any additives on the gut microbiota, such as food, food components, or pharmaceuticals.

Here, we present a protocol for culturing the gut microbiota of the colon in vitro, using a series of bioreactors that simulate the physiological conditions of the gastro intestinal tract.

מתקדמים במבחנה Culturing טכנולוגיה ללמוד את Microbiota בטן האדם

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Bioengineering

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

הכנה של תרבות התא העיקרי באיכות גבוהה של דגים Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Neuroscience

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in overall pH homeostasis. We describe protocols for ratiometric measurement of pH in vivo using pH-sensitive fluorophores localized to the vacuole or cytosol. Vacuolar pH is measured using BCECF, which localizes to the vacuole in yeast when introduced into cells in its acetoxymethyl ester form. Cytosolic pH is measured with a pH-sensitive GFP expressed under control of a yeast promoter, yeast pHluorin. Methods for measurement of fluorescence ratios in yeast cell suspensions in a fluorimeter are described. Through these protocols, single time point measurements of pH under different conditions or in different yeast mutants have been compared and changes in pH over time have been monitored. These methods have also been adapted to a fluorescence plate reader format for high-throughput experiments. Advantages of ratiometric pH measurements over other approaches currently in use, potential experimental problems and solutions, and prospects for future use of these techniques are also described.

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH can be measured in live yeast (S. cerevisiae) cells using ratiometric fluorescent dyes localized to specific cellular compartments. We describe procedures for measuring vacuolar pH with BCECF-AM, which localizes to the vacuole in yeast, and cytosolic pH with a cytosolic ratiometric pH-sensitive GFP (yeast pHluorin).

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

במבחנה ניטור pH חוץ-תאי בזמן אמת

במבחנה ניטור pH חוץ-תאי בזמן אמת

אפיון מעבר אלקטרונים חוץ-תאי מתווך בחיידקי חומצה לקטית עם מערכת ביואלקטרוכימית תלת-אלקטרודתית דו-תאית

אפיון מעבר אלקטרונים חוץ-תאי מתווך בחיידקי חומצה לקטית עם מערכת ביואלקטרוכימית תלת-אלקטרודתית דו-תאית

אפיון מעבר אלקטרונים חוץ-תאי מתווך בחיידקי חומצה לקטית עם מערכת ביואלקטרוכימית תלת-אלקטרודתית דו-תאית

מתקדמים במבחנה Culturing טכנולוגיה ללמוד את Microbiota בטן האדם

הכנה של תרבות התא העיקרי באיכות גבוהה של דגים Pituitaries

מדידה של pH vacuolar וCytosolic