אנו מודים חברי החטיבה למדע הגנום של מעבדה ביולוגיה מערכתית, רפואה, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו. אנו מודים במיוחד ד ר ה Aburatani ד ר טי קודאמה, (LSBM, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו), ד ר ק. Tomizuka, ד ר טי יושידה, ד ר א Kunisato (Kyowa Hakko קירין ושות', בע מ) דיונים מועילים ותמיכה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק הסיוע עבור צעירים מדען (א) (26710005, טי. או), מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (26116711 ו-16 H 01567, טי. או), מענק הסיוע עבור אתגר מחקר גישוש (16K 14605, טי. או) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן, קרן המדע טקדה (טי. או), קרן קוביאשי לחקר הסרטן (טי. או) הפרויקט לחקר הסרטן, האבולוציה טיפולית (P-צור), המחקר המעשי לבקרת סרטן חדשניות של הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED (טי. או).

1. הכנת חומצי תרבות בינוני
<ol><li>
הכנה של שליטה (pH 7.4) ו pH נמוך (pH 6.8) תרבות בינוני
	<ol>
<li>להמיס 4.75 גר' אבקת DMEM בלי-גלוטמין 500 מ ל מים.</li>
		<li>להכין פתרון3 NaHCO 0.33 M בבקבוק לחץ חזק. שים לב: חשוב להשתמש בקבוק לחץ חזק מאז NaHCO3 פולט גז2 CO, כאשר הם מחוממים, תרמית מפורקת.</li>
		<li>אוטוקלב המדיום, פתרון. לאפשר מאגרים אלה להצטנן עד 25 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הוסף 5 מ ל-200 מ מגלוטמין, 5 מ של פניצילין-סטרפטומיצין, ו- 50 מ של העובר סרום שור עד 500 מ"ל של DMEM בלי ביקרבונט.</li>
		<li>שליטה (pH 7.4) בינונית, להוסיף 2.4 מ של 0.33 מ' NaHCO3 פתרון לכל 100 מ של DMEM בלי ביקרבונט. בינוני נמוך-pH (pH 6.8), הוסיפו 0.6 מ"ל של 0.33 מ' NaHCO3 פתרון לכל 100 מ של DMEM בלי ביקרבונט.</li>
		<li>בדוק את ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2. הערה: כמות NaHCO3 פתרון צריכה תיקון בהתאם רמת החומציות בינוני, שיכול להיות שונה בהתאם לתוכן2 CO של החממה, לחץ אוויר. באופן אידיאלי, בפעם הראשונה, עדיף למדוד את רמת ה-pH בינוני עם ריכוזים שונים של ביקרבונט כדי לקבוע את הכמות המתאימה של NaHCO פתרון3 כדי להוסיף DMEM.<ol>
<li>לאסוף את תרבות בינוני מיד לאחר הסרת המנה תרבות החממה2 CO ומדידת רמת ה-pH באמצעות מד pH. לשמור על הטמפרטורה בינוני 37 ° C שימוש באמבט מים במידת הצורך. למדוד את רמת החומציות בינוני שלוש פעמים באופן עצמאי. הערה: NaHCO3 פתרון צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C, צריך להיות מוכן טרי כל מדיה. המוצרים הנמכרים בו ניתן להשתמש במחקר זה מפורטים בטבלה של חומרים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת לקטאט-induced או HCl-induced בינונית תרבות חומצי
	<ol>
<li>להוסיף µL 74 של לקטט פתרון או µL 125 של 1 M HCl 100 מ של שליטה בינונית (להכין בשלב 1.1.5).</li>
		<li>בדוק את ה-pH בינונית לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2. הערה: כמות חומצת החלב או HCl פתרון גם צריך להיות מותאם על פי ה-pH בינוני, שיכול להיות שונה בהתאם לתוכן2 CO חממה, לחץ אוויר. באופן אידיאלי, עדיף למדוד את רמת ה-pH בינוני עם לקטט טורי או HCl ריכוזים כדי לקבוע את הכמות המתאימה עבור התאמת רמת ה-pH הרצוי של המדיום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. קצירת וטיפול בתאי
<ol><li>להתחיל לטפח תאים ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 לפחות שבוע אחד לפני ביצוע ניסויים. הערה: הקווים תא השתמשו במחקר זה מפורטים בטבלה של חומרים.</li>
	<li>מעבר תאים כאשר הם מגיעים confluency 70-90%. אל תאפשר את התאים להפוך confluent. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים בזמן התרגול היומי.</li>
	<li>לשטוף את התאים על-ידי הוספת 5 מ"ל PBS. האחות של PBS ומוסיפים אנזים התולש כגון 1 מ"ל טריפסין.</li>
	<li>דגירה ב 37 ° C עד התאים מעוגלים, נתחיל לנתק.</li>
	<li>הוסף 5 מ של תרבות בינוני על התאים מנותקת, לנטרל אנזים. העברת התליה תא צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה למשך 3 דקות ב x 300 ג' לשאוב תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים תרבות בינונית.</li>
	<li>לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer Trypan-כחול.</li>
	<li>זרע 5.0 x 105 תאים/טוב של מנה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של מדיום. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.</li>
	<li>האחות המדיום תרבות, לשטוף את התאים עם 5 מ"ל PBS ולהוסיף 10 מ"ל של המדיום תרבות חומצי מוכן בסעיף 1. דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2.</li>
</ol>3. RNA בידוד
<ol><li>האחות תרבות בינוני ולשטוף תאים עם 5 מ"ל PBS. לשבש את התאים על-ידי הוספת ריאגנט החילוץ RNA (ראה טבלאות של חומרים).</li>
	<li>לגרד את המאכל לזמן קצר, ואז להסיר הכימית החילוץ RNA עם פיפטה, להפקיד את ה-RNA החילוץ ריאגנט תא lysate לתוך צינור 1.5 מ. יוצאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 250 µL כלורופורם, לנער את הצינור נמרצות תעזוב ס' 15 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. ואני צנטריפוגה-≥8, 000 g x עבור 5 דקות.</li>
	<li>הסר בזהירות את פאזה מימית באמצעות פיפטה. להשאיר חלק השלב מימית. מקום אחר צינור 1.5 מ.</li>
	<li>מוסיפים אלכוהול איזופרופיל µL 550 לשלב מימית ומערבבים בעדינות. להשאיר בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צנטריפוגה במהירות מירבית (≥ 20, 000 x g) במשך 20 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>יוצקים את אלכוהול איזופרופיל ולהוסיף מים מטופלים 1 מ"ל אתנול 75% ב- DEPC. מערבבים בעדינות. צנטריפוגה ב 8000 g x במשך 5 דקות.</li>
	<li>פיפטה הנחה אתנול ולתת שכדורי מילה נהדרת.</li>
	<li>להוסיף שמים מטופלים כ- 15-25 µL (בהתאם התשואה) של DEPC כדי בגדר RNA. מערבבים ביסודיות.</li>
	<li>למדוד את הריכוז של RNA מבודדים על ידי מדידת OD-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים.</li>
</ol>4. cDNA סינתזה
<ol><li>שילוב הרכיבים הבאים בשפופרת תגובת ה-PCR: עד 5 µg הכולל RNA, 1 µL Oligo dT (50 מיקרומטר) או ערבוב אקראי פריימר (60 מיקרומטר), 1 dNTP 10 מ מ µL, ומים ללא נוקלאז כדי הנפח הכולל של 14 µL.</li>
	<li>לערבב, בקצרה centrifuge הרכיבים באמצעות צנטריפוגה benchtop קטן (~ 5 s). Denature המדגם RNA/פריימר למשך 5 דקות ב 65 º C. ספין בקצרה (~ 5 s) באמצעות benchtop קטן צנטריפוגה, שים המדגם מיד על קרח לפחות 1 דקות.</li>
	<li>הוסף את המרכיבים הבאים: 4 µL 5 x מאגר שעתוק לאחור, 1 µL רוורס טרנסקריפטאז (200 U/µL), 1 µL RNase מעכב (40 U µL). הערה: דוגמאות ערכות זמינים מסחרית מוצגות בטבלה של חומרים
</li>
	<li>קאפ הצינור, לערבב ולאחר מכן centrifuge בקצרה את תוכן באמצעות צנטריפוגה benchtop קטן (~ 5 s). דגירה תערובת התגובה משולב ב 50-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>בטל את התגובה על ידי המקננת ב 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
</ol>5. מדידה של ביטוי גנים חומצה מגיב באמצעות PCR בזמן אמת
<ol><li>לשלב את המרכיבים הבאים בצלחת תגובה 384-ובכן: 1 µL תבנית cDNA, 0.75 µL 10 N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine X, 0.3 µL 50 מיקרומטר קדימה פריימר, 0.3 µL 50 מיקרומטר הפוך תחל, אנזימים µL 1, µL 2.5 10 x Taq פולימראז מאגר, 2.5 µL dNTP 20 מ מ, 16.65 µL מים. הערה: דוגמה של ערכות זמינים מסחרית מוצגים בטבלה של חומרים. רשימת צבעי יסוד מוצג בטבלה 1. צלחת 96-ובכן התגובה יכול לשמש גם בשלב זה. ניתן להשתמש גם הגששים אחרים (למשל, Taqman בדיקה).</li>
	<li>הגדרת הניסוי ואת התוכנית הבאה של ה-PCR על מערכת ה-PCR בזמן אמת: 50 º C למשך 2 דקות, מחזור 1; 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מחזור 1; 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C עבור 1 דקות, 40 מחזורי; 95 ° C 15 s, מחזור 1; 60 ° C 15 s, מחזור 1; 95 ° C 15 s, מחזור 1.</li>
	<li>מקם את הצלחת המכשיר qPCR. הפעלת התוכנית. הערה: קולטנים Upregulation של גנים מגיב pH MSMO1, INSIG1ו- IDI1 נמדד על ידי רמות החלבון.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

המחבר קונדו הוא עובד של Kyowa Hakko קירין ושות', בע מ

כאן, אנחנו תיאר מערכת תרבות פשוטה pH חומצי, תהליך ההערכה שלו. השילוב בין שלוש שיטות של acidification בינוני, כלומר, ריכוז ביקרבונט מופחתת, לקטט תוספת תוספת HCl, אפשרו לנו לחקור באופן יסודי את מנגנון ה-pH-תגובה וכדי להשוות את התגובה התאית גידול אחרים תנאים microenvironmental כגון הרעבה היפוקסיה או חומר מזי...

Microenvironment הגידול משחק תפקידים חיוניים ב התקדמות הגידול, סרטן התא חילוף החומרים1,2,3. תאים סרטניים נחשפים לעיתים קרובות תנאים כמו היפוקסיה, מניעת מזון ו pH חומצי חוץ-תאית (pHe). עם זאת, תפקידו של pHe בהתקדמות הגידול יש לא הובהרו בהרחבה כמו הרעבה היפוקסיה או חומר מזין. PHe ברקמת הגידול יכול להיות חומצי, להגיע בערך pH 6.84,5. ה-pH חומצי נובע הפרשה glycolytic ואנאירוביים של פרוטונים (H.+), חומצת החלב על ידי סרטן מתרבים תאים5,6.
מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי היסטון חומצי pHe-induced deacetylation חמצון חומצות שומן, אקסוציטוזה של lysosomes חומצי עבור התאקלמות9,108,7,חמור החומצית. עם זאת, המנגנונים דרך איזה acidification חוץ-תאית משפיעה על התנהגות סרטן והזהות של מפתח הרגולטורים ב microenvironment הגידול pH חומצי לא מלא נקבעו. יתר על כן, מספר דיווחים מתוארת מדיה pH חומצי שונים באמצעות ריכוזים לא ברור של ביקרבונט, מאגר טריס, צינורות, HEPES או לקטאט HCl, אבל ישנם כמה דיווחים להפגין את היציבות של מנוכי עונתיות בינונית ולא מקיף השוואה של מספר ברורים media תרבות חומצי7,8,9,10
התירי את הרגולטורים מפתח ושינויים מטבוליים בתאי סרטן בהקשר של acidification חוץ-תאית, אנחנו הקימה פשוטה in vitro לקשרי תרבות מודל לשמירה על pHe חומצי ובחן את התפקיד של pHe סרטן תאים11. באמצעות שיטה זו, אנו נשמר אמצעי התרבות חומצי עם pHe של 6.8 ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2, באמצעות ריכוז ביקרבונט מופחתת בהמדיום תרבות. pH 7.4 שימש כרגיל ושליטה בינוני. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h במהלך התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. כי גליקוליזה משופרת מאיצה הפרשת לא רק פרוטונים, אלא גם לקטט7,8,9, הקמנו גם שיטה תרבות מחקה חמצת לקטאט-induced על-ידי הוספת חומצת החלב במקום לצמצם ריכוז ביקרבונט. בנוסף, HCl-induced pHe חומצי במדיום מאפשר לנו לשלול את האפשרות כי הסלולר התגובות pH חומצי תרבות בינוני אינם עקב ריכוז מופחתת של ביקרבונט. יתר על כן, באמצעות מדיה שונים עם pH של 6.4-7.4 ריכוז ביקרבונט שונים, שנוכל להעריך את מידת pHe השפעות על תגובות הסלולר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

תנאי microenvironment הגידול, כמו היפוקסיה או מזין רעב, משחק תפקידים חיוניים התקדמות סרטן, גידול ממאיר. עם זאת, התפקיד של pH חומצי חוץ-תאי הגידול תוקפנות, המנגנון הבסיסי שלה לא בהרחבה נחקרה בהשוואה לתנאי רעב ובשפתיים או מזין. בנוסף, שיטה תרבות מוגדרים היטב כדי לחקות את microenvironment חומצי חוץ-תאי הגידול לא מלאה דווחה.
כאן אנו מציגים שיטה תרבות פשוטה במבחנה כדי לשמור על pH חומצי חוץ-תאית באמצעות צמצום ביקרבונט ו לקטט מוגבר או HCl ריכוזים במדיום תרבות. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h בעקבות התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. שלושה תנאים ברורים מדיה חומצי במחקר זה מאוד גנים pH מגיב upregulated כגון MSMO1, INSIG1ו- IDI1 לעומת היפוקסיה או מזין רעב. קולטנים upregulation של גנים אלה יכול לשמש כסמן של pH חומצי. טכניקות פשוטות אלו מועילים התירי מנגנונים הבסיסית של גידול ממאיר תחת microenvironment הגידול חומצי. לכן, מערכת התרבות שלנו pH חומצי חוץ-תאית מאפשרת גילוי של pH חומצי הסלולר תגובות לא רק בתאים סרטניים אלא גם תאים ראשוני, כגון תאים אבובית הכליה, ביחס חומצי הפרעות אחרות כולל, חמצת קטוטית סוכרתית, חמצת לקטית, חמצת אבובית הכליה ו חמצת נשימתית.

כדי לקבוע ריכוז ביקרבונט המתאים, אנו מוכן DMEM בטווח של 0 - 8 מ"מ NaHCO3 (סופי ריכוז במדיום תרבות), הצליח בהכנת תרבות המדיה עם pH החל 6.4-7.4 (איור 1). הכנו DMEM עם 8 מ"מ NaHCO3 (pH 7.4) שליטה בינוני, ו 2 מ מ NaHCO3 (pH 6.8) כמדיום עם pH חומצי לפי הדוח הקודם וקבע כי ה-pH חוץ-תא?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Microenvironment הגידול חומצי ממלאת תפקידים חיוניים בהתקדמות הגידול. כדי להעריך את ההשפעות של ה-pH חומצי חוץ-תאית על סרטן תאי במבחנה, הקמנו מערכות פשוטות תרבות חומצי.

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

SCIENTISTS IN ACTION

14.5K Views.  Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Microenvironment הגידול חומצי ממלאת תפקידים חיוניים בהתקדמות הגידול. כדי להעריך את ההשפעות של ה-pH חומצי חוץ-תאית על סרטן תאי במבחנה, הקמנו מערכות פשוטות תרבות חומצי.

Video: Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The plant hormone auxin rapidly stimulates cell elongation in young stems and similar tissues at least in part by an acid-growth mechanism 2, 3. Auxin activates a H+ pump in the plasma membrane, causing acidification of the cell wall solution. Wall acidification activates expansins, which are endogenous cell wall-loosening proteins 4, causing the cell wall to yield to the wall tensions created by cell turgor pressure. As a result, the cell begins to enlarge rapidly. This 'acid growth' phenomenon is readily measured in isolated (nonliving) cell wall specimens. The ability of cell walls to undergo acid-induced extension is not simply the result of the structural arrangement of the cell wall polysaccharides (e.g. pectins), but depends on the activity of expansins 5. Expansins do not have any known enzymatic activity and the only way to assay for expansin activity is to measure their induction of cell wall extension. This video report details the sources and preparation techniques for obtaining suitable wall materials for expansin assays and goes on to show acid-induced extension and expansin-induced extension of wall samples prepared from growing cucumber hypocotyls.
 To obtain suitable cell wall samples, cucumber seedlings are grown in the dark, the hypocotyls are cut and frozen at -80 &deg;C. Frozen hypocotyls are abraded, flattened, and then clamped at constant tension in a special cuvette for extensometer measurements. To measure acid-induced extension, the walls are initially buffered at neutral pH, resulting in low activity of expansins that are components of the native cell walls. Upon buffer exchange to acidic pH, expansins are activated and the cell walls extend rapidly. We also demonstrate expansin activity in a reconstitution assay. For this part, we use a brief heat treatment to denature the native expansins in the cell wall samples. These inactivated cell walls do not extend even in acidic buffer, but addition of expansins to the cell walls rapidly restores their ability to extend.

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

We demonstrate the use of a constant-force extensometer to measure long-term extension (creep) of plant cell wall specimens induced by acidic buffers and expansin protein.

מדידת תא הצמח החומה הרחבה (Creep) מושרה על ידי ה-pH חומצי על ידי Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

הקמתה של תרבות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו Conjugating

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence in real time has been established without the need to count cells in single cell suspension to avoid any growth perturbation. A high-content image analysis system was used to assess iPCS confluence on 4 different ECMs over time in an automated manner. Different analysis settings were used to assess cell confluence of adherent iPSCs and only a slight difference (at 24 and 48 hours with laminin) has been observed whether a 60, 80 or 100% mask was applied. We also show that laminin lead to the best confluence compared to Matrigel, vitronectin and fibronectin.

The goal of the protocol is to compare different extracellular matrix (ECM) coating conditions to assess how differential coating affects the growth rate of induced pluripotent stem cells (iPSCs). In particular, we aim to set up conditions to obtain optimal growth of iPSC cultures.

מדידת המפגש של iPSCs באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, nutrients, metabolites, pathogens, and the microbiota. Methods to culture intestinal organoids are now available for multiple species, including pigs, which is a species of major interest both as a farm animal and as a translational model for humans, for example, to study zoonotic diseases. Here, we give an in-depth description of a procedure used to culture pig intestinal 3D organoids from frozen epithelial crypts. The protocol describes how to cryopreserve epithelial crypts from the pig intestine and the subsequent procedures to culture 3D intestinal organoids. The main advantages of this method are (i) the temporal dissociation of the isolation of crypts from the culture of 3D organoids, (ii) the preparation of large stocks of cryopreserved crypts derived from multiple intestinal segments and from several animals at once, and thus (iii) the reduction in the need to sample fresh tissues from living animals. We also detail a protocol to establish cell monolayers derived from 3D organoids to allow access to the apical side of epithelial cells, which is the site of interactions with nutrients, microbes, or drugs. Overall, the protocols described here is a useful resource for studying the pig intestinal epithelium in veterinary and biomedical research.

Here, we describe a protocol to culture pig intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts. We also describe a method to establish cell monolayers derived from 3D organoids, allowing access to the apical side of epithelial cells.

תרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזרזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה והקמת חד-שכבות תאים

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

בידוד משופר של בועיות חוץ-תאיות חיידקיות עבור מיקרוביוטה רב-אומית

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

מחבר זרקור: האצת המחקר על הפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות והטרוגניות 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.