Agradecemos os membros da divisão de ciência do genoma e laboratório de sistemas de biologia e medicina, RCAST, a Universidade de Tóquio. Agradecemos especialmente Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, a Universidade de Tóquio), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida e Dr. A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin, Ltd.) para suporte e discussões úteis. Este trabalho foi parcialmente suportado pelo subsídio para jovem cientista (A) (26710005, T.O.), subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (26116711 e 16 H 01567, T.O.) e subsídio para desafiador Pesquisa exploratória (16K 14605, T.O.) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão, a Fundação de ciência Takeda (T.O.), Fundação de pesquisa do câncer (T.O.) Kobayashi e o projeto para pesquisa do câncer e Evolução terapêutica (P-criar) e a pesquisa de prática de controle do câncer inovadoras da Agência Japonesa para a pesquisa médica e desenvolvimento, AMED (T.O.).

1. preparação do meio de cultura de ácido
<ol><li>
Preparação do controle (pH 7,4) e o meio de cultura de baixo pH (pH 6,8)
	<ol>
<li>Dissolva 4,75 g de pó DMEM sem L-glutamina em 500 mL de água.</li>
		<li>Prepare a solução de 0,33 M NaHCO3 em uma garrafa de pressão-apertado. Atenção: É importante que utilize uma garrafa de pressão apertado NaHCO3 emite CO2 gás quando aquecido e decomposto termicamente.</li>
		<li>Autoclave a médio e a solução. Permitir que esses buffers esfriar a 25 ° C.</li>
		<li>Adicionar 5 mL de 200 mM L-glutamina, 5 mL de penicilina-estreptomicina e 50 mL de soro bovino fetal a 500 mL de DMEM sem bicarbonato.</li>
		<li>Por meio de controle (pH 7,4), adicione 2,4 mL de solução de 0,33 M NaHCO3 por 100 mL de DMEM sem bicarbonato. Por meio do baixo-pH (pH 6,8), adicione 0,6 mL da solução de 0,33 M NaHCO3 por 100 mL de DMEM sem bicarbonato.</li>
		<li>Verificar o pH médio após 24h de incubação a 37 ° C, menos de 5% de CO2. Nota: A quantidade de solução de NaHCO3 precisa ser ajustada dependendo do pH médio, que pode diferir dependendo do teor de CO2 da incubadora e a pressão de ar. Idealmente, pela primeira vez, é melhor medir o pH médio com diferentes concentrações de bicarbonato, para determinar a quantidade adequada de solução de NaHCO3 para adicionar DMEM.<ol>
<li>Recolher o meio de cultura imediatamente após a remoção da placa de cultura a incubadora de CO2 e medir o pH com um medidor de pH. Manter a temperatura média a 37 ° C, utilizando um banho de água se necessário. Medir o pH médio três vezes independentemente. Nota: NaHCO3 solução deve ser armazenada a 4 ° C e deve ser preparadas de cada mídia. Produtos comercialmente disponíveis que podem ser usados neste estudo são listados na Tabela de materiais.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando o lactato-induzido ou induzido por HCl Ácido meio de cultura
	<ol>
<li>Adicione 74 µ l de solução de lactato ou 125 µ l de 1 M de HCl a 100 mL de meio de controle (preparado na etapa 1.1.5).</li>
		<li>Verificar o pH médio após 24h de incubação a 37 ° C, menos de 5% de CO2. Nota: A quantidade de lactato ou solução de HCl também precisa ser ajustado de acordo com o pH médio, que pode diferir dependendo do teor de CO2 na incubadora e pressão de ar. Idealmente, é melhor medir o pH médio com lactato serial ou concentrações de HCl para determinar a quantidade adequada de ajuste para o pH desejado do meio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. a colheita e o tratamento de células
<ol><li>Começa a cultivar células a 37 ° C, menos de 5% de CO2 pelo menos 1 semana antes de realizar experimentos. Nota: A linha de celular utilizada neste estudo é listada na Tabela de materiais.</li>
	<li>Células de passagem quando eles alcançam a confluência de 70-90%. Não permita que as células se tornar confluentes. Altere o meio de cada 2-3 dias durante o cultivo diariamente.</li>
	<li>Lave as células pela adição de 5 mL de PBS. Aspirar a PBS e adicionar enzima desmontar como 1ml tripsina.</li>
	<li>Incube a 37 ° C até que as células são arredondadas e começarem a separar.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de meio de cultura para as células desanexadas e desactivar a enzima. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL e centrifugar por 3 min em 300 x g. Aspire o sobrenadante e ressuspender as células com meio de cultura.</li>
	<li>Conte as células viáveis usando um hemocytometer e azul Trypan.</li>
	<li>Semente 5.0 x 105 células/poço de um prato de 10 cm em 10 mL de meio. Incube as celulas por 24 h a 37 ° C abaixo de 5% de CO2.</li>
	<li>Aspire o meio de cultura, lavam-se as células com 5 mL de PBS e adicionar 10 mL de meio de cultura ácido preparado na secção 1. Incube as celulas por 24 h a 37 ° C abaixo de 5% de CO2.</li>
</ol>3. isolamento de RNA
<ol><li>Aspire o meio de cultura e lavam-se células com 5 mL de PBS. Romper as células, adicionando o reagente de extração de RNA (ver Tabelas de materiais).</li>
	<li>Raspe o prato brevemente, em seguida remover o reagente de extração de RNA com uma pipeta e depositar o RNA extração reagente/lisado celular em um tubo de 1,5 mL. Deixe em temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Adicionar 250 clorofórmio µ l e agite o tubo vigorosamente durante cerca de 15 s. deixar em temperatura ambiente por 5 min e centrifugar em ≥ 8, 000 x g durante 5 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente a fase aquosa com uma pipeta. Deixe para trás alguns da fase aquosa. Coloque em outro tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicionar a fase aquosa 550 µ l isopropanol e misture delicadamente. Deixe em temperatura ambiente por 5 min. centrifugar a máxima velocidade (≥ 20 000 x g) por 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Despeje o isopropanol e adicionar 1 mL de etanol a 75% em DEPC água tratada. Misture suavemente. Centrifugar a 8.000 x g durante 5 min.</li>
	<li>Pipetar o etanol e deixe que secar ao ar livre as pelotas.</li>
	<li>Adicione que aproximadamente 15-25 µ l (dependendo do rendimento) de DEPC água tratada para a pelota do RNA. Misture bem.</li>
	<li>Medir a concentração de RNA isolado medindo a D.O. a 260 nm, utilizando um espectrofotômetro.</li>
</ol>4. síntese de cDNA
<ol><li>Combinar os seguintes componentes em um tubo de reação de PCR: até 5 µ g RNA total, 1 µ l Oligo dT (50 µM) ou mistura aleatória de Primer (60 µM), 1 µ l 10mm dNTP e água nuclease livre para um volume total de 14 µ l.</li>
	<li>Misture e centrifugar brevemente os componentes utilizando uma centrífuga de bancada pequena (~ 5 s). Desnaturar a amostra de RNA/primer por 5 min a 65 ° C. Girar brevemente (~ 5 s) usando uma pequena bancada centrifugue e colocar a amostra prontamente no gelo pelo menos 1 min.</li>
	<li>Adicione os seguintes componentes: 4 µ l 5 x buffer de transcrição reversa, 1 µ l Transcriptase reversa (200 U / µ l), 1 µ l inibidor de RNase (40 U / µ l). Nota: Exemplos de kits comercialmente disponíveis são mostrados na Tabela de materiais
</li>
	<li>Tampa do tubo, misture e brevemente centrifugar o conteúdo utilizando uma centrífuga de bancada pequena (~ 5 s). Incube a mistura de reação combinada a 50-55 ° C por 10 min.</li>
	<li>Inativar a reação incubando a 80 ° C por 10 min.</li>
</ol>5. medida da expressão do Gene ácido-responsivo usando PCR em tempo real
<ol><li>Combinar os seguintes componentes em uma placa de reação 384-bem: 1 µ l modelo do cDNA, 0,75 µ l 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µ l 50 µM para a frente primeira demão, 0,3 µ l 50 µM reverso da primeira demão, polymerase de Taq 1 µ l, 2,5 µ l 10 x buffer do polymerase de Taq, 2,5 µ l 20 mM dNTP, 16.65 µ l água. Nota: O exemplo dos kits comercialmente disponíveis são mostrados na Tabela de materiais. Uma lista das primeiras demão é mostrada na tabela 1. Uma placa de 96 poços de reação também pode ser usada nesta etapa. Outras sondas (por exemplo, sonda Taqman) também podem ser usadas.</li>
	<li>Configurar a experiência e o seguinte programa PCR em um sistema de PCR em tempo real: 50 ° C por 2 min, 1 ciclo; 95 ° C por 10 min, 1 ciclo; 95 ° C por 15 s e 60 ° C por 1 min, 40 ciclos; 95 ° C por 15 s, 1 ciclo; 60 ° C durante 15 s, 1 ciclo; 95 ° C por 15 s, 1 ciclo.</li>
	<li>Coloque a placa no instrumento qPCR. Inicie o programa. Nota: Upregulation dos genes responsivos pH MSMO1, INSIG1e IDI1 podem ser medido pelos níveis de proteína.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

O autor Ayano Kondo é um empregado da Kyowa Hakko Kirin co., Ltd.

Aqui, descrevemos um sistema de cultura simples pH ácido e seu processo de avaliação. A combinação de três métodos de acidificação média, ou seja, concentração de bicarbonato reduzido, adição de lactato e adição de HCl, permitiu-nos investigar o mecanismo de pH-resposta completamente e comparar a resposta celular a outro tumor Microenvironmental condições tais como a fome de hipóxia ou nutriente.
A chave deste método é para determinar as concentrações adequadas ...

O microambiente do tumor tem um papel crítico na progressão do tumor e câncer célula metabolismo1,2,3. As células cancerosas são frequentemente expostas a condições tais como hipóxia, privação de nutrientes e ácido pH extracelular (pHe). No entanto, o papel de pHe em progressão do tumor não foi clarificado tão extensivamente como fome de hipóxia ou nutriente. O pHe no tecido do tumor pode se tornar ácida, atingindo aproximadamente pH 6,84,5. O pH ácido surge da excreção glicolítico aeróbia e anaeróbica de prótons (H+) e lactato pela proliferação do câncer células5,6.
Estudos recentes revelaram que ácida induzida pela pHe histona deacetilação, oxidação do ácido graxo e exocitose de lisossomos ácidos para adaptação ao ambiente ácido grave7,8,9,10. No entanto, os mecanismos através do qual acidificação do extracelular afeta o comportamento do câncer e a identidade da chave reguladores no microambiente do tumor de pH ácido não foram totalmente determinados. Além disso, vários relatos descritos vários meios de pH ácido, usando pouco claras concentrações de bicarbonato, tampão Tris, tubulações e HEPES ou lactato e HCl, mas há poucos relatórios para demonstrar a estabilidade do ajustado média nem abrangente comparação de vários meios distintos de cultura ácida7,8,9,10
Para elucidar os reguladores chaves e alterações metabólicas em células cancerosas no contexto da acidificação do extracelular, que estabeleceu um modelo de cultura simples em vitro para manter um pHe ácida e examinou o papel de pHe em células de câncer11. Usando esse método, mantivemos um meio de cultura ácido com um pHe de 6,8 a 37 ° C abaixo dos 5% CO2, com as concentrações de bicarbonato reduzida do meio de cultura. pH 7,4 utilizou-se como normal e controle médio. O pH médio foi mantido pelo menos 24 h e gradualmente diminuiu 72 h durante a cultura de células de câncer pancreático PANC-1 e 1-AsPC. Porque reforçada glicólise acelera a excreção de prótons, não só mas também lactato7,8,9, estabelecemos também um método de cultura imitando acidose induzida por lactato por adição de lactato, em vez de reduzir o concentração de bicarbonato. Além disso, induzida por HCl Ácido pHe no meio nos permite excluir a possibilidade de respostas celulares ao meio de cultura de pH ácido não são devido a uma concentração reduzida de bicarbonato. Além disso, usando vários meios de comunicação com um pH de 6,4 a 7,4 com concentração diferente de bicarbonato, podemos avaliar a extensão dos efeitos de pHe em respostas celulares.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium&amp;ldquo;Nissui&amp;rdquo; 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td><td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>Lactic acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368702&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell lines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0432</td><td></td></tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Cell Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Condições do microambiente do tumor, como hipóxia ou inanição nutriente, desempenham um papel crítico na progressão do câncer e malignidade. No entanto, o papel do pH extracelular ácido na agressividade do tumor e seu mecanismo subjacente não foi extensivamente estudado em comparação com as condições de inanição hipóxica ou nutrientes. Além disso, um método de cultura bem definidos para imitar o microambiente do tumor extracelular ácidas não totalmente relatou.
Aqui nós apresentamos um método de cultura simples em vitro para manter o pH extracelular ácido usando reduzido bicarbonato e lactato aumentado ou concentrações de HCl em meio de cultura. O pH médio foi mantido pelo menos 24 h e gradualmente diminuiu de 72 h após a cultura de células de câncer pancreático PANC-1 e 1-AsPC. Três condições distintas mídia ácida neste estudo altamente upregulated pH-responsivo genes tais como MSMO1, INSIG1e IDI1 em comparação com hipoxia ou inanição nutriente. O upregulation destes genes pode ser usado como um marcador de pH ácido. Estas técnicas simples são benéficas para elucidar os mecanismos subjacentes de malignidade do tumor sob o microambiente do tumor ácidas. Portanto, nosso sistema de cultura de pH ácido extracelular permite a descoberta de respostas celulares pH ácido não só nas células cancerosas, mas também em células primárias, tais como células tubulares renais, em relação as outros ácidos distúrbios incluindo, cetoacidose diabética, acidose láctica, acidose tubular renal e acidose respiratória.

Para determinar a concentração de bicarbonato apropriado, estamos preparados DMEM no intervalo de 0 - 8 mM NaHCO3 (concentração final do meio de cultura) e teve sucesso na preparação de meios de cultura com pH variando de 6,4-7,4 (Figura 1). Estamos preparados DMEM com 8mm NaHCO3 (pH 7,4) como um meio de controle e 2mm NaHCO3 (pH 6,8) como um meio com pH ácido de acordo com um relatório anterior, afirmando que o pH ext...

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Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

O microambiente do tumor ácido tem um papel crítico na progressão do tumor. Para avaliar os efeitos do pH extracelular ácido sobre câncer células in vitro, estabelecemos sistemas simples cultura ácidas.

Estabelecimento de um pH extracelular ácido sistema de cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

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Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

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Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Avaliação da viabilidade de um consórcio bacteriano sintético na Interface Host-micróbio em Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Bioquímica

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

Real-tempo, semi-automatizado de medição fluorescente do pH líquido de superfície das vias aéreas das células epiteliais das vias aéreas humanas primárias

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

<meta charset="utf8"></head><body>Monitoramento in vitro do pH extracelular em tempo real

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

In vitro Monitoramento do pH extracelular em tempo real

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Análise cronoamperométrica de EET em Lactiplantibacillus plantarum com DHNA

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron acceptor. This electron acceptor can be an electrode and electrons can be delivered indirectly via a redox-active mediator molecule. Here, we present a protocol to study mediated EET in Lactiplantibacillus plantarum, a probiotic lactic acid bacterium widely used in the food industry, using a bioelectrochemical system. We detail how to assemble a three-electrode, two-chambered bioelectrochemical system and provide guidance on characterizing EET in the presence of a soluble mediator using chronoamperometry and cyclic voltammetry techniques. We use representative data from 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)-mediated EET experiments with L. plantarum to demonstrate data analysis and interpretation. The techniques described in this protocol can open new opportunities for electro-fermentation and bioelectrocatalysis. Recent applications of this electrochemical technique with L. plantarum demonstrated an acceleration of metabolic flux towards producing fermentation end-products, which are critical flavor components in food fermentation. As such, this system has the potential to be further developed to alter flavors in food production or produce valuable chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Caracterização da transferência de elétrons extracelular mediada em bactérias do ácido lático com um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras

Here we present a protocol for characterizing mediated extracellular electron transfer (EET) in lactic acid bacteria using a three-electrode, two-chamber bioelectrochemical system. We illustrate this method with Lactiplantibacillus plantarum and the redox mediator 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid and provide a thorough description of the electrochemical techniques used to evaluate mediated EET.

Caracterização da transferência de elétrons extracelular mediada em bactérias do ácido lático com um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its complex nature, and its diverse association with mammalian components. The goal of this protocol is to culture the gut microbiota in vitro, which allows for the study of the gut microbiota dynamics, without having to consider the contribution of the mammalian milieu. Using in vitro culturing technology, the physiological conditions of the gastro intestinal tract are simulated, including parameters such as pH, temperature, anaerobiosis, and transit time. The intestinal surface of the colon is simulated by adding mucin-coated carriers, creating a mucosal phase, and adding further dimension. The gut microbiota is introduced by inoculating with the human fecal material. Upon inoculation with this complex mixture of bacteria, specific microbes are enriched in the different longitudinal (ascending, transverse and descending colons) and transversal (luminal and mucosal) environments of the in vitro model. It is crucial to allow the system to reach a steady state, in which the community and the metabolites produced remain stable. The experimental results in this manuscript demonstrate how the inoculated gut microbiota community develops into a stable community over time. Once steady state is achieved, the system can be used to analyze bacterial interactions and community functions or to test the effects of any additives on the gut microbiota, such as food, food components, or pharmaceuticals.

Here, we present a protocol for culturing the gut microbiota of the colon in vitro, using a series of bioreactors that simulate the physiological conditions of the gastro intestinal tract.

Aplicação avançada em Vitro cultivo tecnologia para estudar a Microbiota do intestino humano

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Bioengenharia

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

Preparação de uma cultura de célula primária de alta qualidade do peixe Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Neurociência

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in overall pH homeostasis. We describe protocols for ratiometric measurement of pH in vivo using pH-sensitive fluorophores localized to the vacuole or cytosol. Vacuolar pH is measured using BCECF, which localizes to the vacuole in yeast when introduced into cells in its acetoxymethyl ester form. Cytosolic pH is measured with a pH-sensitive GFP expressed under control of a yeast promoter, yeast pHluorin. Methods for measurement of fluorescence ratios in yeast cell suspensions in a fluorimeter are described. Through these protocols, single time point measurements of pH under different conditions or in different yeast mutants have been compared and changes in pH over time have been monitored. These methods have also been adapted to a fluorescence plate reader format for high-throughput experiments. Advantages of ratiometric pH measurements over other approaches currently in use, potential experimental problems and solutions, and prospects for future use of these techniques are also described.

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH can be measured in live yeast (S. cerevisiae) cells using ratiometric fluorescent dyes localized to specific cellular compartments. We describe procedures for measuring vacuolar pH with BCECF-AM, which localizes to the vacuole in yeast, and cytosolic pH with a cytosolic ratiometric pH-sensitive GFP (yeast pHluorin).

Estabelecimento de um pH extracelular ácido sistema de cultura

Resumo

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Avaliação da viabilidade de um consórcio bacteriano sintético na Interface Host-micróbio em Vitro Gut

Real-tempo, semi-automatizado de medição fluorescente do pH líquido de superfície das vias aéreas das células epiteliais das vias aéreas humanas primárias

In vitro Monitoramento do pH extracelular em tempo real

In vitro Monitoramento do pH extracelular em tempo real

Caracterização da transferência de elétrons extracelular mediada em bactérias do ácido lático com um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras

Caracterização da transferência de elétrons extracelular mediada em bactérias do ácido lático com um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras

Caracterização da transferência de elétrons extracelular mediada em bactérias do ácido lático com um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras

Aplicação avançada em Vitro cultivo tecnologia para estudar a Microbiota do intestino humano

Preparação de uma cultura de célula primária de alta qualidade do peixe Pituitaries

Medição do valor pH vacuolar e Cytosolic