Astyanax mexicanus ، المعروف أيضا باسم سمك الكهف المكسيكي الأعمى ، وبرز ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من مجالات البحوث في العلوم البيولوجية ، وتحديدا في فهم تطور الصفات الوراثية التكيفية. ويتكون هذا النوع من تحول سطح يسكن النهر وتحول مسكن كهف يسمح لنا بتحليل كيفية اختلاف اثنين من السكان من نفس النوع مع مرور الوقت. ومع ذلك، من أجل إجراء هذا البحث يجب أن نكون قادرين على الحصول على الأجنة الصحية المتطابقة زمنياً والخروج الهجين.
في حين أن هذا النوع يتم الحفاظ عليه بسهولة وتربية في المختبر الأسماك تفرخ في المقام الأول خلال ساعات الليل مما يجعل من الصعب الحصول على الأجنة وضعت حديثا خلال النهار. في هذا البروتوكول نعرض كيف من خلال التأقلم Astyanax mexicanus إلى دورات الضوء المتغيرة وتغيرات درجة الحرارة ونحن قادرون على تحويل دورات تربية إلى وقت أكثر ملاءمة من اليوم. بعد ذلك، نعرض كيفية تحديد الأسماك المناسبة للوالدين وجمع الأم من الذكور والإناث المُلقنين.
وأخيراً، نُظهر كيفية إنتاج نسل قابل للحياة باستخدام الإخصاب في المختبر ونناقش علامات الإخصاب الناجح. ونتوقع أن يتيح هذا البروتوكول إجراء إجراءات مثل حقن النشئات الوراثية وتحليل النمو بسهولة خلال ساعات العمل العادية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة في خلق التباعد المختلط بين جميع تجمعات الكهوف والمساكن السطحية.
قم بإعداد خزانات الأسماك داخل نظام استزراع مائي مبهم ومغلق بالكامل يحتوي على صفوف متعددة من الخزانات. الحفاظ على درجة حرارة كل خزان مع عنصر التدفئة المستقلة التي تستخدم لتغيير درجة الحرارة يدويا أثناء عملية فتيلة. قم بإعداد صفوف فردية بطريقة لتمكين الصور الضوئية المنفصلة في كل منها.
تثبيت الأبواب على كل صف التي يمكن إغلاقها لمنع الضوء من الدخول أو الهروب. يمكن أن وحدة تحكم الآلي تمكين التلاعب من جميع photoperiods مع أقل اضطراب للأسماك. تجهيز الرف مع ضوء العمل الأحمر وستائر التعتيم للوصول خلال ساعات الظلام.
إزالة الأسماك المطلوبة من رفوف النظام العام ووضع في رفوف تربية للسماح لتعديل photoperiod 14 يوما قبل فتيلة. وهذا يسمح للأسماك بالتأقلم مع بيئة جديدة. الحفاظ على الأسماك عند 22.8 درجة مئوية خلال هذه الفترة باستخدام نظام التدفئة المائية المثبتة.
الضوئي العادي هو ستة أ.m إلى ثمانية p.m ضوء، وثمانية .m.
إلى ستة a.m.dark. لرف دورة الضوء تحول photoperiod إلى 10 p.m. إلى 12 p.m.
الضوء، و12 .m. إلى 10 p.m. الظلام عن طريق ضبط الموقت الذي القوى الضوء داخل الرف.
مرة واحدة يتم التأقلم الأسماك بدء فتيلة الحيوانات لتفريخ. هذا هو الإجراء الذي يستغرق ستة أيام في المجموع. على هذا وقت غيّر الدرجة حرارة إلى رئيس الزّاوا إنتاج يستعمل تثبيت نظامة تدفئة مائيّة.
في اليوم الأول رفع درجة الحرارة من 22.8 درجة مئوية إلى 24.4 درجة مئوية. في اليوم الثاني رفع درجة الحرارة من 24.4 درجة مئوية إلى 26.1 درجة مئوية. في اليوم الثالث و الرابع يبقيان درجة الحرارة عند 26.1 درجة مئوية
وسوف تكون الأسماك على استعداد لتفرخ خلال النهار ويمكن إجراء التلقيح الاصطناعي. في اليوم الخامس انخفاض درجة الحرارة من 26.1 درجة مئوية إلى 24.4 درجة مئوية. في اليوم السادس انخفاض درجة الحرارة من 24.4 درجة مئوية إلى 22.8 درجة مئوية.
توفير فجوة لمدة سبعة أيام قبل تكرار دورة درجة الحرارة هذه. نوصي بالاستمرار في الحفاظ على الأسماك في هذا photoperiod لأن هذا سوف يقلل من الوقت الإجمالي الذي تحتاجه الأسماك للتكيف مع دورة الضوء المتغيرة. تبدأ عن طريق إدراج مسح الأنسجة مبللة في غطاء طبق بيتري وإغلاق الطبق لإنشاء غرفة مرطبة ومنع البويضات من الجفاف أثناء عملية جمع.
المقبل اختيار أنثى لجمع. من المرجح أن تكون أسماك جرافيد ذات البطن البراحظ كبيرة الخيار الأفضل لهذا الإجراء. شل حركة أنثى باستخدام الماء المبرد ووضعها في موقف سوبين في حامل الإسفنج مبللة.
مرة واحدة وضع لطخة الجانب البطني من الأسماك مع مسح الأنسجة الحساسة كما الاتصال بالماء سوف يسبب البويضة لتنشيط. عقد الأنثى بين الإبهام وسببة. الضغط بلطف ضد الجانبين الجانبي للتجويف coelomic في اتجاه فتح البولي التناسلي في حين المتداول الاصبع قليلا.
جمع البويضات التي أعرب عنها باستخدام ملعقة المتاح. نقل هذه إلى طبق بيتري المرطب. ويمكن الجمع بين العديد من براثن من البويضات في نفس الطبق إذا لم تكن هناك حاجة إلى بيانات محددة عن الوالدين.
بعد جمع بلطف عودة الأسماك إلى خزان الانتعاش مليئة المياه النظام. اختيار الذكور لجمع. لا توجد علامات واضحة ظاهريًا لجودة راتة الذكور.
ومع ذلك، يجب أن تظهر الأسماك في حالة صحية في المظهر قبل استخدامها في هذا الإجراء. شل حركة ذكر باستخدام الماء المبرد ووضعه في موقف سوبين في حامل الإسفنج مبللة. لطخة الجانب البطني من الأسماك مع مسح الأنسجة الحساسة كما الاتصال بالماء سوف تنشط milt.
ضع بلطف نهاية أنبوب الشعيرات الدموية عند فتحة البولي التناسلية. طرد milt عن طريق تطبيق ضغط لطيف على جانبي السمكة مع الإبهام والسبابة. بدء ابتعاد عن الخياشيم تتحرك نحو فتح البولي التناسلي.
جمع milt في نهاية أنبوب شعري. قد يكون من الضروري شفط لطيف عن طريق استخدام أنبوب الزفير. تجنب أي براز التي قد تكون طردت مع milt.
الاستغناء milt في أنبوب جهاز طرد مركزي فارغ 1.5 ملليلتر وتمييع مع ضعف حجم تمديد الحيوانات المنوية E400. حافظ على الثلج. قد يتم تجميع Milt من عدة ذكور معًا إذا لم تكن هناك حاجة إلى بيانات تربية محددة.
يمكن استخدام هذه الخطوة لتمديد وقت العمل من milt لعدة ساعات، ولكن ليست مطلوبة للتخصيب الفوري. بعد جمع بلطف عودة الأسماك إلى خزان الانتعاش مليئة المياه النظام. باستخدام ماصة جديدة لكل مخزون مزيج الحيوانات المنوية عن طريق الأنابيب و / أو تهيج الجانبين من الأنبوب قبل الإخصاب والحيوانات المنوية وmilt وتسوية في حل E400 مع مرور الوقت.
الاستغناء عن milt أو حل milt الموسعة في البويضات التي تم جمعها حديثا. سرعان ما يضاف ملليلتر واحد من المياه النظام إلى مخلب لتنشيط الحيوانات المنوية والبويضات للتخصيب. تجنب خلط أو تهيج محتويات الطبق والسماح لمدة دقيقتين للتخصيب أن يحدث.
إضافة E2 وسائط الجنين لملء الطبق 2/3 كامل. اعتمادا على الإجراء اللاحق الأجنة يمكن أن تستخدم على الفور لتطبيقات المصب أو أنها يمكن أن تحضن في وسائل الإعلام الجنين E2 في 23 درجة مئوية حتى تصل إلى خمسة أيام بعد الإخصاب. عند هذه النقطة نقوم بنقل الأجنة إلى نظام الإسكان الرئيسي إعادة تدوير باستخدام نظام المياه.
القوة الرئيسية لهذا الأسلوب هو إنتاج موثوق بها من الكهوف والهجينة السطحية من المكسيكية Astyanax. الطرق التقليدية للإنتاج الهجين هي صعبة للغاية بسبب فقدان إيقاع circadian في كهف morphotype من المكسيكية Astyanax، مما يؤدي إلى تغيير أوقات التفريخ من هذه الأسماك. لإجراء التلقيح الاصطناعي الناجح في Astyanax mexicanus فإن جودة البويضات التي تم جمعها ذات أهمية كبرى.
غرافيد الإناث الأسماك مع البطن جاحظ كبير هي الأكثر عرضة لإطلاق البويضات قابلة للحياة، والتي تبدو واضحة وحتى في المظهر. إضافة milt التي تم جمعها إلى هذه النتائج في تطوير الأجنة المخصبة عادة في غضون 20 إلى 30 دقيقة. سوف تصبح الأجنة القابلة للحياة أكثر شفّاً قليلاً قبل دخول مرحلة الخلية الواحدة من دورة النمو.
سوف تبدو البويضات غير المخصبة أكثر تفاوتًا وغموضًا. باستخدام التلقيح الاصطناعي لتوليد الهجينة من سمك الكهف tenaja والأسماك السطحية يمكن للمرء أن يفحص مجموعة واسعة من الأنماط الظاهرية المورفولوجية. على سبيل المثال، السطح / كهف الهجينة لديها عيون تشير إلى وجود العينين هي سمة مهيمنة.
في كهف سطح F2 الهجينة ومع ذلك, نحصل على مجموعة واسعة من أحجام العين مما يدل على أن هناك loci متعددة التي تتحكم حجم العين في المكسيكي Astyanax مما يجعلها سمة كمية. مثال آخر هو التصبغ. مراقبة الهجين F1 من سطح وسمك الكهف، يمكن أن يُستنتج أن تصبغ الجسم هو سمة مهيمنة حيث أن الأسماك مصطبغة بالكامل.
في الجيل F2 الاختلاف في تصبغ الجسم مرة أخرى يشير نحو سمة كمية. يمكن أن يكشف الجمع بين هذه البيانات الظاهرية مع بيانات التسلسل عن بؤرة جينية ناصحة عن هذه الأنماط الظاهرية. تعلمنا في هذا البروتوكول كيفية تحويل دورات تربية المكسيكي أستياناكس إلى ساعات أكثر ملاءمة من اليوم، والحصول على أجنة صحية قابلة للحياة باستخدام الإخصاب في المختبر.
بالإضافة إلى السماح بالعمل مع الأجنة في المراحل المبكرة ، فإنه يتيح أيضًا استكشاف الحيوانات المنوية في المستقبل. توحيد هذه التقنية يعزز Astyanax mexicanus كنظام نموذجي للدراسات التنموية والوراثية في وقت مبكر.
