Wir möchten Alejandro Sánchez Alvarado, danken, die die anfänglichen Optimierung und Entwicklung dieser Technik unterstützt. Im Carolyn Adler Labor ist von Cornell University Startkapital unterstützt.

1. Vorbereitung
<ol><li>
Aufbereitung des Wassers planaria 17<ol>
<li>Planarien in einem 1 X Montjuïc-Salz-Lösung zu erhalten. Um Planarian Wasser vorzubereiten, stellen Sie einzelne Stammlösungen 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl und 5 M NaCl Reinstwasser. Sterilisieren Sie Filter-mit 0,2 µm Flasche-Top Filterfor anhaltender Lagerung. Hinweis: Verwenden Sie nur hochreines entionisiertem Wasser (mit einem Widerstand von 18,2 MΩ bei 25 ° C), Montjuïc Salze vorzubereiten.</li>
		<li>Kombinieren Sie, um eine 1 L Brühe von 5 X Salzlösung vorzubereiten, 5 mL 1 M CaCl2, 5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL MgCl2, 0,5 mL KCl und 1,6 mL 5 M NaCl-Lösungen in 900 mL Reinstwasser. Fügen Sie zu dieser Lösung 0,504 g Nahco33 hinzu und unter Rühren Sie mischen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit Salzsäure.</li>
		<li>Diese 5 X Stammlösung 1 X arbeiten Konzentration in Reinstwasser in einen sterilen Behälter wie z. B. eine große Kapazität Korbflasche verdünnen (siehe die Tabelle der Materialien). Verwenden Sie diese 1 X Lösung für die Aufrechterhaltung der asexuellen Planarien. Hinweis: Als Alternative zum Montjuïc-Salz-Lösung zu verwenden, vor Ort gekauft Quellwasser oder Reinstwasser mit einem handelsüblichen Aquarium Salz mischen (siehe Tabelle der Materialien), um eine Konzentration of0.5 g/L18.</li>
		<li>Zur Vermeidung von bakteriellen Infektionen in statischer Kultur19pflegen Sie Planarien in Wasser mit einem Antibiotikum. Bereiten Sie eine 50 mg/mL Stammlösung von Gentamicin Sulfat Reinstwasser und sterilisieren Sie Filter zu. Fügen Sie Gentamicin Sulfat Behälter wo Tiere gepflegt werden hinzu, um eine Endkonzentration von 50 µg/mL (Verdünnung 1: 1000).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Leberpastete
	<ol>
<li>Wie Planarien auf eine Diät von Bio gedeihen, Grünfutterbasis Leber, kaufen Sie frische Leber und Vorgang innerhalb von 24 Std. entfernt die häutigen Kapsel Kapseln der Leberzellkrebs durch vorsichtig abziehen. Schneiden Sie die Leber in ~ 1 cm Würfel, und verwenden Sie ein Messer abkratzen und verwerfen alle hepatischen Venen und Arterien.</li>
		<li>Mazerat Leber Stücke mit einer Passiermühle oder einer Küchenmaschine und dann durch ein Sieb Essen Draht passieren. Kombinieren Sie in Spritzbeutel und in Spritzen oder 35-mm-Petrischalen zu verzichten. Zentrifugieren Sie vor der Fütterung sanft um Luftblasen zu entfernen.</li>
		<li>Aliquote der Leber bei-80 ° C bis zu einem Jahr und Tauwetter vor der Verwendung zu speichern. Nach dem Auftauen wieder frieren Sie alle übrig gebliebenen Leber einmal ein oder bei 4 ° C bis zu 24 Stunden speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pflege der Tiere
	<ol>
<li>Planarien wachsen und schrumpfen zu verschiedenen Größen abhängig von der Häufigkeit der Fütterung. Füttern Sie Planarien jede zweite Woche (einmal alle 14 Tage). Verwenden Sie für langfristige Bulk Kulturen Kunststoff-Behälter in verschiedenen Größen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Um die Tiere zu füttern, verwenden Sie einen Spachtel aus Metall oder Kunststoff Transferpipette einen erbsengroßer Tropfen der Leber in eine Box Platz. Ermöglichen Sie Tiere, für 1-2 h entfernen übrig gebliebene Essen zu essen, vor dem Reinigen der Box.</li>
		<li>Würmer, zweimal in der Woche (einmal direkt nach der Fütterung und einmal zwei Tage später) gefüttert oder einmal pro Woche zu reinigen, wenn Sie nicht gefüttert. Zur Reinigung lassen Sie Wasser in einen Kunststoffbecher sorgfältig gießt das Wasser unter Beibehaltung Planarien im Feld. Wischen Sie Box-Oberfläche mit einem Papiertuch ab, dann auf allen Seiten wiederholen Sie, bis die Box sauber ist.</li>
		<li>Wasser (ca. ¾ der das Gehäusevolumen) zu ersetzen und eine Endkonzentration von 50 µg/mL Gentamicin hinzufügen. Lagern Sie Tiere in einem dunklen Schrank oder in einem Inkubator 20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auswahl von worms
	<ol>
<li>Wählen Sie die Würmer, die 5-7 Tage zuvor gefüttert wurden. Hinweis: Es ist wesentlich schwieriger zu Pharynges von Würmern zu amputieren, die vor kurzem (1-2 Tage vor der Amputation) gefüttert wurden. Gefütterten Tiere sind auch empfindlicher auf Natriumazid.</li>
		<li>Wählen Sie die Würmer, die etwa 6 mm in der Länge sind. Um die Größe des Wurms zu schätzen, auf einer Petrischale mit einer Pipette aus Kunststoff Übertragung übertragen. Legen Sie eine flache 6 - In-Lineal oder Zeichenpapier mit Maßeinteilung 5 x 5 mm unterhalb der Petrischale und Messen Sie die Länge der Wurm, während es kriecht. Hinweis: Würmer, die kleiner als 6 mm in der Länge sind schwieriger zu amputieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung von Natriumazid
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 100 mM-Lösung von Natrium-Azid Pulver in Planaria Wasser auflösen. Vorsicht: Natriumazid ist giftig und sollte vorsichtig behandelt werden. Verwerfen Sie Natriumazid den Abfluss nicht. Nach der Verwendung es separat zur Entsorgung als Sondermüll zu sammeln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Pharynx Amputation
<ol><li>Ort Würmer in einem 35-mm-Durchmesser Petrischale. Entfernen Sie vorsichtig alle Planarian Wasser aus der Schüssel mit einem Kunststoff Transferpipette. Hinweis: Maximal 20 6-mm-Würmer kann bequem in eine Schüssel mit dieser Größe untergebracht werden.</li>
	<li>Die Schale unter dem Mikroskop und Vergrößerung so einstellen, dass mehrere Würmer gleichzeitig angezeigt werden können (z.B. 10 X Vergrößerung). Ersetzen Sie Planarian Wasser mit 100 mM Natrium-Azid Lösung. Hinweis: Für eine 35-mm-Petrischale reicht etwa 5 mL von Natriumazid. Die Lösung sollte vollständig Planarien Tauchen. Lautstärke Lösung für größere Gerichte wie nötig.</li>
	<li>Beobachten Sie die Tiere unter dem Mikroskop und Refrain vom Gericht für die ersten 3-4 min bewegen.</li>
	<li>Die Extrusion des Rachens durch das Mikroskop zu beobachten; des Rachens wird ragen aus dem Rachenraum Beutel und vollständig zu verlängern (ca. 1 mm in der Länge) wie in Abbildung 1 bgezeigt. Hinweis: Es ist wichtig zu warten, bis der Pharynx Verlängerung komplett abgeschlossen hat, bevor Sie fortfahren. Sobald der Rachen des Tieres entsteht, dauert Vollauszug etwa 1 min.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Kunststoff Transferpipette Tiere rund um die Schale zu spritzen. Saugen Sie die Tiere in das pipettieren und lassen Sie sie gewaltsam in die Schüssel ein paar Mal. Wenn der Rachen voll ausgefahren ist, verursacht diese kräftig Pipettieren lösen.</li>
	<li>Alternativ erfassen des Rachens entweder vertikal entlang seiner Länge, oder horizontal entlang seines Umfangs mit einer feinen Pinzette (siehe Tabelle der Materialien), wie in Abbildung 1dargestellt. Heben Sie mit den Pharynx in der Zange gequetscht das Tier nach oben in Richtung der Meniskus. Da das Tier ausgelöst wird, wird Oberflächenspannung des Rachens, trennen Sie das Tier verursachen. Hinweis: Diese Methode kann verwendet werden, entfernen die Pharynges von kleineren Tieren (1-3 mm in der Länge) wo ist kraftvoll wirbeln nicht ausreichend. Vermeiden Sie stossen oder anderweitig verletzt den Körper des Tieres.</li>
	<li>Bewegen Sie mit eine Transferpipette Amputierte Tieren auf ein neues Gericht mit frischen Planaria Wasser.</li>
	<li>Einmal übertragen, spülen Sie amputierten Tiere gründlich mit Planaria Wasser, komplett tauschen das Wasser dreimal. Übertragen Sie auf eine neue Schale mit Planaria Wasser mit 50µg/mL von Gentamicin. Hinweis: Komplette Buffer Tausch während dieser drei Wäschen ist unerlässlich, Entfernung von Natriumazid gewährleistet.</li>
	<li>Ersetzen Sie am nächsten Tag Wasser in der Schale mit frischen Planaria wasserhaltige 50 µg/mL von Gentamicin. Wiederholen Sie jeden zweiten Tag danach.</li>
</ol>3. Bewertung der Pharynx Entfernung nach Amputation
<ol><li>Tiere unter dem Mikroskop (mit 10-20 X Vergrößerung) zu untersuchen, um festzustellen, ob ein dunkler Fleck nach Abwahl des Rachens, erschienen ist, wie in Abbildung 2Agezeigt.</li>
	<li>Alternativ zu beheben Sie und Bleichen Sie Tiere nach dem Protokoll von Pearson Et Al. beschrieben 20. Einweichen Tiere über Nacht in 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder Gewebekulturen konjugiert Streptavidin (1 mg/mL verdünnt 1: 500, 1 X Phosphat Buffered Saline mit 0,3 % Triton-X). Tiere auf Folien in 80 % glycerol/20% 1 X Phosphat Buffered Saline und Bild unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop (Abb. 2 b) montieren. Hinweis: Alle Bilder in dieser Handschrift wurden auf eine fluoreszierende Stereomikroskop mit einem 1,0 X Ziel erfasst.</li>
</ol>4. Bewertung der Pharynx Regeneration durch Messung Fressverhalten
<ol><li>
Vorbereitung der Leber
	<ol>
<li>Übertragen Sie benötigte Menge an Leberpastete in einem Microcentrifuge oder konische Rohr. Kurz drehen Sie, um Luftblasen zu entfernen. Schätzen Sie das Volumen der Leber, und dann fügen Sie Planaria Wasser zu 1/5 seines Volumens und 2 % des Gesamtvolumens in rote Lebensmittelfarbe hinzu. Z. B. 1000 µL Leber fügen Sie ein, fügen Sie 200 µL Planaria Wasser und 24 µL Lebensmittelfarbe.</li>
		<li>Mit Kunststoff Stößel, Pipettenspitze oder Metallspatel, gründlich mischen Sie, bis Lebensmittelfarbe in der Leber-Paste gleichmäßig verteilt wird. Noch einmal kurz drehen. Leberpastete kann bei 4 ° C für 24 h gespeichert oder in Aliquote bei-80 ° C für die langfristige Lagerung eingefroren.</li>
		<li>Wenn bis zu 25 Tieren testen, bereiten Sie 25 µL Leberpastete pro Schale (ca. 1 µL Leberpastete pro Tier).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fütterung der Tiere
	<ol>
<li>Übertragen Sie sieben Tage nach chemischen Amputation, Tiere auf eine neue Petrischale. Wenn 10-15 Tiere zu testen, verwenden Sie eine 35 mm-Gericht; mehr als 15 Tiere sollten in einer 60 mm Petrischale getestet werden. Halten Sie Tiere in der Dunkelheit, ungestört, ca. 1 h vor der Fütterung.</li>
		<li>Mit Schere, verbreitern Sie die Pipettenspitze ein P200 durch Trimmen etwa ½ cm weg von dem schmalen Ende. Pipettieren 25 µL der roten Leberpastete in die Schüssel. Hinweis: Ende trimmen macht Pipettieren der viskosen Leberpastete einfacher. Damit die Leber nicht schwimmt auf der Oberfläche, berühren Sie die Spitze an der Unterseite der Schale unter Verzicht auf.</li>
		<li>Können Sie Tiere, 30 min. lang zu ernähren.</li>
		<li>Ergebnis der Anzahl von Tieren, die gegessen haben, indem die Tiere auf einem weißen Hintergrund oder Untersuchung unter dem Mikroskop mit 10-20 X Vergrößerung.</li>
		<li>Nach der Fütterung, Leber aus der Schale entfernen und reinigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+and+Cellular+Choreography+of+Appendage+Regeneration.">The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration.</a> Cell. 165, 1598-1608 (2016).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur selektiven Abtragen des Rachens mit Natriumazid. Weitere gezielte Ablation Studien in Planarien haben geänderte Chirurgie verwendet, um Photorezeptoren21 oder pharmakologische Behandlung zu dopaminergen Neuronen22abtragen zu entfernen. Ein großer Vorteil der chemischen Amputation über bestehende Methoden ist, dass es keine Operation erfordert. Die starre Struktur des Rachens verglichen mit dem Rest des Körpers Planarian erlei...

Regeneration ist ein Phänomen, das im gesamten Tierreich, mit regenerativen Kapazitäten von Ganzkörper-Regeneration in bestimmten Wirbellosen bis hin zu mehr eingeschränkten Fähigkeiten in Wirbeltieren1auftritt. Ersatz von funktionellen Geweben ist ein komplexer Prozess und oft bringt die gleichzeitige Wiederherstellung mehrere Zelltypen. Zum Beispiel Salamander Gliedmaßen, Osteoblasten, Chondrozyten, Nervenzellen, Muskeln und Epithelzellen müssen sich regenerieren2ersetzt. Außerdem müssen diese neu erzeugten Zelltypen richtig organisiert werden, um die neue Funktion der Gliedmaße zu erleichtern. Das Verständnis dieser komplexen Prozesse erfordert Techniken, die auf Regeneration von bestimmten Zelltypen und ihre Integration in die Organe zu konzentrieren.
Die Strategien, die Studie der regenerativen Antworten zu vereinfachen gehört die gezielte Ablation von bestimmten Zelltypen oder größere Sammlungen von Geweben. Beispielsweise führt die Expression des Nitroreductase in bestimmten Zelltypen im Zebrafisch, zu deren Vernichtung nach Anwendung von Metronidazol3,4. In Drosophila -Larven Abtragen mit dem Ausdruck Pro-apoptotische Gene unter gewebespezifische Promotoren gezielt bestimmte Regionen des imaginalen Scheibe5,6. Beide dieser Strategien rasch, aber kontrollierten Schaden anrichten, und wurden verwendet, um die molekularen und zellulären Mechanismen für die Regeneration verantwortlich zu sezieren.
In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode, um eine ganze Organ namens des Rachens in die Planarian Schmidtea Mediterraneaselektiv abtragen. Planarien sind ein klassisches Modell der Regeneration, bekannt für ihre fruchtbaren Regenerationsfähigkeit, wo selbst kleinste Fragmente ganze Tiere 7,8wieder nachwachsen. Sie haben eine große, heterogene Bevölkerung von Stammzellen, die aus pluripotenten Zellen und Linie beschränkt Stammväter9,10,11. Diese Zellen vermehren sich und differenzieren, um alle fehlenden Gewebe, einschließlich des Rachens, Nerven-, Verdauungs- und Ausscheidungsorgane Systeme und Muskel und Epithelzellen9,10,12zu ersetzen. Wir wissen, dass diese Stammzellen Regeneration einzuleiten, tun wir nicht vollständig verstehen Sie, die molekularen Mechanismen, die sie zu diesen verschiedenen Zelltypen ersetzen fahren. Definierte verletzte Methoden, die präzise Stammzellen Reaktionen auslösen können helfen, diesen komplexen Prozess abzugrenzen.
Der Pharynx ist eine große, zylindrische Röhre benötigt für die Fütterung und enthält Neuronen, Muskel, epithelialen und sekretorischen Zellen13,29. Normalerweise versteckt in einer Tasche an der Bauchseite des Tieres, es erstreckt sich über einzelne Körper des Tieres auf das Vorhandensein von Nahrung sensing öffnen. Um selektiv den Pharynx amputieren, genießen wir Planarien in einer chemischen genannt Natriumazid, eine häufig verwendete Anästhetikum in C. Elegans14,15,16. Seine Verwendung in Planarien wurde erstmals berichtet, von Adler Et Al., 2014-12. Innerhalb von Minuten der Exposition gegenüber Natriumazid Planarien extrudieren Sie ihre Pharynges und mit sanften Agitation des Rachens trennt das Tier. Dieser vollständige und selektiven Verlust des Rachens bezeichnen wir als "chemische Amputation". Eine Woche nach der Amputation, ist eine voll funktionsfähige Rachen restaurierten12. Da Rachens für Fütterung erforderlich ist, kann funktionelle Regeneration gemessen werden, durch die Überwachung Fressverhalten. Im folgenden beschreiben wir das Protokoll für chemische Amputation und für die Beurteilung der Regeneration des Rachens und Wiederherstellung der Fressverhalten.

<table><tbody><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-3</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65-3</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Acros/VWR</td><td>41341-5000</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>196770010</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>207790050</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>123360010</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot</td><td>ThermoFisher Scientific/VWR</td><td>2324-0015</td><td>Storing planaria water</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Spectrum Brands</td><td>Amazon</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-100P</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Mincing liver&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Disposable pastry bags-16&amp;rdquo;, 12 pack</td><td>Wilton</td><td>Amazon</td><td>Liver aliquots</td></tr><tr><td>5 mL syringes</td><td>BD/VWR</td><td>309647</td><td>Liver aliquots</td></tr><tr><td>Petri dishes-35mm/60mm</td><td>Greiner Bio-One/VWR</td><td>82050-536/82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Plastic containers (various sizes)</td><td>Ziploc</td><td>Amazon</td><td>Housing planarians in static culture</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Globe Scientific</td><td>138030</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont Tweezer, Style 5</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>72700-D (0203-5-PO)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-1</td><td></td></tr></tbody></table>

chemical amputation and regeneration of the pharynx in the planarian schmidtea mediterranea

Planarien sind Plattwürmer, die äußerst effizient auf Regeneration. Sie verdanken diese Fähigkeit, eine große Anzahl von Stammzellen, die auf jeder Art von Verletzungen schnell reagieren können. Häufige Verletzungen Modelle in diesen Tieren entfernen Sie große Mengen von Gewebe, die mehrere Organe schädigt. Um dieses breite Gewebeschäden zu überwinden, beschreiben wir hier eine Methode, um gezielt ein einzelnes Organ, des Rachens in die Planarian Schmidtea Mediterraneaentfernen. Dies erreichen wir durch Einweichen Tiere in eine Lösung mit der Cytochrom-Oxidase-Hemmer Natriumazid. Kurze Exposition gegenüber Natriumazid verursacht Extrusion des Rachens vom Tier, nennen wir "chemische Amputation." Chemischen Amputation entfernt den gesamten Rachenraum und erzeugt eine kleine Wunde, wo der Pharynx in den Darm legt. Nach umfangreichen spülen, regeneriert alle Amputierte Tieren eine voll funktionsfähige Rachen in etwa einer Woche. Stammzellen in den Rest des Körpers fahren Regeneration des neuen Rachens. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum chemischen Amputation und histologische und Verhaltensstörungen Methoden zur Beurteilung der erfolgreichen Amputation und Regeneration zu beschreiben.

Exposition gegenüber Natriumazid stört die normale Beweglichkeit der Planarien, Tiere zu dehnen und Winden verursacht. Diese Bewegungen zwingen den Rachen von der ventralen Seite des Tieres entstehen, und nach ca. 6 min. in Natrium-Azid-Lösung, die weiße Spitze des Rachens zu sehen (Abbildung 1 b-linken). Ein paar Minuten später, Tiere aktiv zusammenziehen und des Rachens durch Drücken Sie ihn gewaltsam aus dem Körper vollständig zu e...

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Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Das Planarian Schmidtea Mediterranea ist ein hervorragendes Modell für das Studium Stammzellen und Regeneration des Gewebes. Diese Publikation beschreibt eine Methode, um ein Organ, des Rachens, selektiv zu entfernen, indem man Tiere, die chemische Natriumazid. Dieses Protokoll beschreibt auch Methoden für die Überwachung des Rachens Regeneration.

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

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Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Aufrufe.  Cornell University. Das Planarian Schmidtea Mediterranea ist ein hervorragendes Modell für das Studium Stammzellen und Regeneration des Gewebes. Diese Publikation beschreibt eine Methode, um ein Organ, des Rachens, selektiv zu entfernen, indem man Tiere, die chemische Natriumazid. Dieses Protokoll beschreibt auch Methoden für die Überwachung des Rachens Regeneration.

Serie: Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Untersuchung von Blut Zellpopulationen des<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

Ein planarischer Motilitätstest zur Messung der biomodulierenden Eigenschaften natürlicher Produkte

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Biochemie

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Biologie

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarien Immobilisierung, partielle Bestrahlung, und Gewebetransplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Planarian Scrunching als quantitatives Behavioral Readout für Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Planarian Ovary Dissection for Ultrastructural Analysis and Antibody Staining

Accessibility to germ cells allows the study of germ cell development, meiosis, and recombination. The sexual biotype of the freshwater planarian, Schmidtea mediterranea, is a powerful invertebrate model to study the epigenetic specification of germ cells. Unlike the large number of testis and male germ cells, planarian oocytes are relatively difficult to locate and examine, as there are only two ovaries, each with 5-20 oocytes. Deeper localization within the planarian body and lack of protective epithelial tissues also make it challenging to dissect planarian ovaries directly. 
This protocol uses a brief fixation step to facilitate the localization and dissection of planarian ovaries for downstream analysis to overcome these difficulties. The dissected ovary is compatible for ultrastructural examination by transmission electron microscopy (TEM) and antibody immunostaining. The dissection technique outlined in this protocol also allows for gene perturbation experiments, in which the ovaries are examined under different RNA interference (RNAi) conditions. Direct access to the intact germ cells in the ovary achieved by this protocol will greatly improve the imaging depth and quality and allow cellular and subcellular interrogation of oocyte biology.

<meta charset="utf8"></head><body>Planarien-Ovarialdissektion für die Ultrastrukturanalyse und Antikörperfärbung

This protocol presents steps taken to dissect ovaries in the freshwater planarians, Schmidtea mediterranea. The dissected ovaries are compatible for antibody immunostaining and ultrastructural analysis with transmission electron microscopy to study the cell biology of the oocytes and somatic cells, providing an imaging depth and quality that were previously inaccessible.

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Zusammenfassung

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Untersuchung von Blut Zellpopulationen des

Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone