Wir möchten Alejandro Sánchez Alvarado, danken, die die anfänglichen Optimierung und Entwicklung dieser Technik unterstützt. Im Carolyn Adler Labor ist von Cornell University Startkapital unterstützt.

1. Vorbereitung
<ol><li>
Aufbereitung des Wassers planaria 17<ol>
<li>Planarien in einem 1 X Montjuïc-Salz-Lösung zu erhalten. Um Planarian Wasser vorzubereiten, stellen Sie einzelne Stammlösungen 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl und 5 M NaCl Reinstwasser. Sterilisieren Sie Filter-mit 0,2 µm Flasche-Top Filterfor anhaltender Lagerung. Hinweis: Verwenden Sie nur hochreines entionisiertem Wasser (mit einem Widerstand von 18,2 MΩ bei 25 ° C), Montjuïc Salze vorzubereiten.</li>
		<li>Kombinieren Sie, um eine 1 L Brühe von 5 X Salzlösung vorzubereiten, 5 mL 1 M CaCl2, 5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL MgCl2, 0,5 mL KCl und 1,6 mL 5 M NaCl-Lösungen in 900 mL Reinstwasser. Fügen Sie zu dieser Lösung 0,504 g Nahco33 hinzu und unter Rühren Sie mischen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit Salzsäure.</li>
		<li>Diese 5 X Stammlösung 1 X arbeiten Konzentration in Reinstwasser in einen sterilen Behälter wie z. B. eine große Kapazität Korbflasche verdünnen (siehe die Tabelle der Materialien). Verwenden Sie diese 1 X Lösung für die Aufrechterhaltung der asexuellen Planarien. Hinweis: Als Alternative zum Montjuïc-Salz-Lösung zu verwenden, vor Ort gekauft Quellwasser oder Reinstwasser mit einem handelsüblichen Aquarium Salz mischen (siehe Tabelle der Materialien), um eine Konzentration of0.5 g/L18.</li>
		<li>Zur Vermeidung von bakteriellen Infektionen in statischer Kultur19pflegen Sie Planarien in Wasser mit einem Antibiotikum. Bereiten Sie eine 50 mg/mL Stammlösung von Gentamicin Sulfat Reinstwasser und sterilisieren Sie Filter zu. Fügen Sie Gentamicin Sulfat Behälter wo Tiere gepflegt werden hinzu, um eine Endkonzentration von 50 µg/mL (Verdünnung 1: 1000).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Leberpastete
	<ol>
<li>Wie Planarien auf eine Diät von Bio gedeihen, Grünfutterbasis Leber, kaufen Sie frische Leber und Vorgang innerhalb von 24 Std. entfernt die häutigen Kapsel Kapseln der Leberzellkrebs durch vorsichtig abziehen. Schneiden Sie die Leber in ~ 1 cm Würfel, und verwenden Sie ein Messer abkratzen und verwerfen alle hepatischen Venen und Arterien.</li>
		<li>Mazerat Leber Stücke mit einer Passiermühle oder einer Küchenmaschine und dann durch ein Sieb Essen Draht passieren. Kombinieren Sie in Spritzbeutel und in Spritzen oder 35-mm-Petrischalen zu verzichten. Zentrifugieren Sie vor der Fütterung sanft um Luftblasen zu entfernen.</li>
		<li>Aliquote der Leber bei-80 ° C bis zu einem Jahr und Tauwetter vor der Verwendung zu speichern. Nach dem Auftauen wieder frieren Sie alle übrig gebliebenen Leber einmal ein oder bei 4 ° C bis zu 24 Stunden speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pflege der Tiere
	<ol>
<li>Planarien wachsen und schrumpfen zu verschiedenen Größen abhängig von der Häufigkeit der Fütterung. Füttern Sie Planarien jede zweite Woche (einmal alle 14 Tage). Verwenden Sie für langfristige Bulk Kulturen Kunststoff-Behälter in verschiedenen Größen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Um die Tiere zu füttern, verwenden Sie einen Spachtel aus Metall oder Kunststoff Transferpipette einen erbsengroßer Tropfen der Leber in eine Box Platz. Ermöglichen Sie Tiere, für 1-2 h entfernen übrig gebliebene Essen zu essen, vor dem Reinigen der Box.</li>
		<li>Würmer, zweimal in der Woche (einmal direkt nach der Fütterung und einmal zwei Tage später) gefüttert oder einmal pro Woche zu reinigen, wenn Sie nicht gefüttert. Zur Reinigung lassen Sie Wasser in einen Kunststoffbecher sorgfältig gießt das Wasser unter Beibehaltung Planarien im Feld. Wischen Sie Box-Oberfläche mit einem Papiertuch ab, dann auf allen Seiten wiederholen Sie, bis die Box sauber ist.</li>
		<li>Wasser (ca. ¾ der das Gehäusevolumen) zu ersetzen und eine Endkonzentration von 50 µg/mL Gentamicin hinzufügen. Lagern Sie Tiere in einem dunklen Schrank oder in einem Inkubator 20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auswahl von worms
	<ol>
<li>Wählen Sie die Würmer, die 5-7 Tage zuvor gefüttert wurden. Hinweis: Es ist wesentlich schwieriger zu Pharynges von Würmern zu amputieren, die vor kurzem (1-2 Tage vor der Amputation) gefüttert wurden. Gefütterten Tiere sind auch empfindlicher auf Natriumazid.</li>
		<li>Wählen Sie die Würmer, die etwa 6 mm in der Länge sind. Um die Größe des Wurms zu schätzen, auf einer Petrischale mit einer Pipette aus Kunststoff Übertragung übertragen. Legen Sie eine flache 6 - In-Lineal oder Zeichenpapier mit Maßeinteilung 5 x 5 mm unterhalb der Petrischale und Messen Sie die Länge der Wurm, während es kriecht. Hinweis: Würmer, die kleiner als 6 mm in der Länge sind schwieriger zu amputieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung von Natriumazid
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 100 mM-Lösung von Natrium-Azid Pulver in Planaria Wasser auflösen. Vorsicht: Natriumazid ist giftig und sollte vorsichtig behandelt werden. Verwerfen Sie Natriumazid den Abfluss nicht. Nach der Verwendung es separat zur Entsorgung als Sondermüll zu sammeln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Pharynx Amputation
<ol><li>Ort Würmer in einem 35-mm-Durchmesser Petrischale. Entfernen Sie vorsichtig alle Planarian Wasser aus der Schüssel mit einem Kunststoff Transferpipette. Hinweis: Maximal 20 6-mm-Würmer kann bequem in eine Schüssel mit dieser Größe untergebracht werden.</li>
	<li>Die Schale unter dem Mikroskop und Vergrößerung so einstellen, dass mehrere Würmer gleichzeitig angezeigt werden können (z.B. 10 X Vergrößerung). Ersetzen Sie Planarian Wasser mit 100 mM Natrium-Azid Lösung. Hinweis: Für eine 35-mm-Petrischale reicht etwa 5 mL von Natriumazid. Die Lösung sollte vollständig Planarien Tauchen. Lautstärke Lösung für größere Gerichte wie nötig.</li>
	<li>Beobachten Sie die Tiere unter dem Mikroskop und Refrain vom Gericht für die ersten 3-4 min bewegen.</li>
	<li>Die Extrusion des Rachens durch das Mikroskop zu beobachten; des Rachens wird ragen aus dem Rachenraum Beutel und vollständig zu verlängern (ca. 1 mm in der Länge) wie in Abbildung 1 bgezeigt. Hinweis: Es ist wichtig zu warten, bis der Pharynx Verlängerung komplett abgeschlossen hat, bevor Sie fortfahren. Sobald der Rachen des Tieres entsteht, dauert Vollauszug etwa 1 min.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Kunststoff Transferpipette Tiere rund um die Schale zu spritzen. Saugen Sie die Tiere in das pipettieren und lassen Sie sie gewaltsam in die Schüssel ein paar Mal. Wenn der Rachen voll ausgefahren ist, verursacht diese kräftig Pipettieren lösen.</li>
	<li>Alternativ erfassen des Rachens entweder vertikal entlang seiner Länge, oder horizontal entlang seines Umfangs mit einer feinen Pinzette (siehe Tabelle der Materialien), wie in Abbildung 1dargestellt. Heben Sie mit den Pharynx in der Zange gequetscht das Tier nach oben in Richtung der Meniskus. Da das Tier ausgelöst wird, wird Oberflächenspannung des Rachens, trennen Sie das Tier verursachen. Hinweis: Diese Methode kann verwendet werden, entfernen die Pharynges von kleineren Tieren (1-3 mm in der Länge) wo ist kraftvoll wirbeln nicht ausreichend. Vermeiden Sie stossen oder anderweitig verletzt den Körper des Tieres.</li>
	<li>Bewegen Sie mit eine Transferpipette Amputierte Tieren auf ein neues Gericht mit frischen Planaria Wasser.</li>
	<li>Einmal übertragen, spülen Sie amputierten Tiere gründlich mit Planaria Wasser, komplett tauschen das Wasser dreimal. Übertragen Sie auf eine neue Schale mit Planaria Wasser mit 50µg/mL von Gentamicin. Hinweis: Komplette Buffer Tausch während dieser drei Wäschen ist unerlässlich, Entfernung von Natriumazid gewährleistet.</li>
	<li>Ersetzen Sie am nächsten Tag Wasser in der Schale mit frischen Planaria wasserhaltige 50 µg/mL von Gentamicin. Wiederholen Sie jeden zweiten Tag danach.</li>
</ol>3. Bewertung der Pharynx Entfernung nach Amputation
<ol><li>Tiere unter dem Mikroskop (mit 10-20 X Vergrößerung) zu untersuchen, um festzustellen, ob ein dunkler Fleck nach Abwahl des Rachens, erschienen ist, wie in Abbildung 2Agezeigt.</li>
	<li>Alternativ zu beheben Sie und Bleichen Sie Tiere nach dem Protokoll von Pearson Et Al. beschrieben 20. Einweichen Tiere über Nacht in 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder Gewebekulturen konjugiert Streptavidin (1 mg/mL verdünnt 1: 500, 1 X Phosphat Buffered Saline mit 0,3 % Triton-X). Tiere auf Folien in 80 % glycerol/20% 1 X Phosphat Buffered Saline und Bild unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop (Abb. 2 b) montieren. Hinweis: Alle Bilder in dieser Handschrift wurden auf eine fluoreszierende Stereomikroskop mit einem 1,0 X Ziel erfasst.</li>
</ol>4. Bewertung der Pharynx Regeneration durch Messung Fressverhalten
<ol><li>
Vorbereitung der Leber
	<ol>
<li>Übertragen Sie benötigte Menge an Leberpastete in einem Microcentrifuge oder konische Rohr. Kurz drehen Sie, um Luftblasen zu entfernen. Schätzen Sie das Volumen der Leber, und dann fügen Sie Planaria Wasser zu 1/5 seines Volumens und 2 % des Gesamtvolumens in rote Lebensmittelfarbe hinzu. Z. B. 1000 µL Leber fügen Sie ein, fügen Sie 200 µL Planaria Wasser und 24 µL Lebensmittelfarbe.</li>
		<li>Mit Kunststoff Stößel, Pipettenspitze oder Metallspatel, gründlich mischen Sie, bis Lebensmittelfarbe in der Leber-Paste gleichmäßig verteilt wird. Noch einmal kurz drehen. Leberpastete kann bei 4 ° C für 24 h gespeichert oder in Aliquote bei-80 ° C für die langfristige Lagerung eingefroren.</li>
		<li>Wenn bis zu 25 Tieren testen, bereiten Sie 25 µL Leberpastete pro Schale (ca. 1 µL Leberpastete pro Tier).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fütterung der Tiere
	<ol>
<li>Übertragen Sie sieben Tage nach chemischen Amputation, Tiere auf eine neue Petrischale. Wenn 10-15 Tiere zu testen, verwenden Sie eine 35 mm-Gericht; mehr als 15 Tiere sollten in einer 60 mm Petrischale getestet werden. Halten Sie Tiere in der Dunkelheit, ungestört, ca. 1 h vor der Fütterung.</li>
		<li>Mit Schere, verbreitern Sie die Pipettenspitze ein P200 durch Trimmen etwa ½ cm weg von dem schmalen Ende. Pipettieren 25 µL der roten Leberpastete in die Schüssel. Hinweis: Ende trimmen macht Pipettieren der viskosen Leberpastete einfacher. Damit die Leber nicht schwimmt auf der Oberfläche, berühren Sie die Spitze an der Unterseite der Schale unter Verzicht auf.</li>
		<li>Können Sie Tiere, 30 min. lang zu ernähren.</li>
		<li>Ergebnis der Anzahl von Tieren, die gegessen haben, indem die Tiere auf einem weißen Hintergrund oder Untersuchung unter dem Mikroskop mit 10-20 X Vergrößerung.</li>
		<li>Nach der Fütterung, Leber aus der Schale entfernen und reinigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+and+Cellular+Choreography+of+Appendage+Regeneration.">The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration.</a> Cell. 165, 1598-1608 (2016).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur selektiven Abtragen des Rachens mit Natriumazid. Weitere gezielte Ablation Studien in Planarien haben geänderte Chirurgie verwendet, um Photorezeptoren21 oder pharmakologische Behandlung zu dopaminergen Neuronen22abtragen zu entfernen. Ein großer Vorteil der chemischen Amputation über bestehende Methoden ist, dass es keine Operation erfordert. Die starre Struktur des Rachens verglichen mit dem Rest des Körpers Planarian erlei...

Regeneration ist ein Phänomen, das im gesamten Tierreich, mit regenerativen Kapazitäten von Ganzkörper-Regeneration in bestimmten Wirbellosen bis hin zu mehr eingeschränkten Fähigkeiten in Wirbeltieren1auftritt. Ersatz von funktionellen Geweben ist ein komplexer Prozess und oft bringt die gleichzeitige Wiederherstellung mehrere Zelltypen. Zum Beispiel Salamander Gliedmaßen, Osteoblasten, Chondrozyten, Nervenzellen, Muskeln und Epithelzellen müssen sich regenerieren2ersetzt. Außerdem müssen diese neu erzeugten Zelltypen richtig organisiert werden, um die neue Funktion der Gliedmaße zu erleichtern. Das Verständnis dieser komplexen Prozesse erfordert Techniken, die auf Regeneration von bestimmten Zelltypen und ihre Integration in die Organe zu konzentrieren.
Die Strategien, die Studie der regenerativen Antworten zu vereinfachen gehört die gezielte Ablation von bestimmten Zelltypen oder größere Sammlungen von Geweben. Beispielsweise führt die Expression des Nitroreductase in bestimmten Zelltypen im Zebrafisch, zu deren Vernichtung nach Anwendung von Metronidazol3,4. In Drosophila -Larven Abtragen mit dem Ausdruck Pro-apoptotische Gene unter gewebespezifische Promotoren gezielt bestimmte Regionen des imaginalen Scheibe5,6. Beide dieser Strategien rasch, aber kontrollierten Schaden anrichten, und wurden verwendet, um die molekularen und zellulären Mechanismen für die Regeneration verantwortlich zu sezieren.
In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode, um eine ganze Organ namens des Rachens in die Planarian Schmidtea Mediterraneaselektiv abtragen. Planarien sind ein klassisches Modell der Regeneration, bekannt für ihre fruchtbaren Regenerationsfähigkeit, wo selbst kleinste Fragmente ganze Tiere 7,8wieder nachwachsen. Sie haben eine große, heterogene Bevölkerung von Stammzellen, die aus pluripotenten Zellen und Linie beschränkt Stammväter9,10,11. Diese Zellen vermehren sich und differenzieren, um alle fehlenden Gewebe, einschließlich des Rachens, Nerven-, Verdauungs- und Ausscheidungsorgane Systeme und Muskel und Epithelzellen9,10,12zu ersetzen. Wir wissen, dass diese Stammzellen Regeneration einzuleiten, tun wir nicht vollständig verstehen Sie, die molekularen Mechanismen, die sie zu diesen verschiedenen Zelltypen ersetzen fahren. Definierte verletzte Methoden, die präzise Stammzellen Reaktionen auslösen können helfen, diesen komplexen Prozess abzugrenzen.
Der Pharynx ist eine große, zylindrische Röhre benötigt für die Fütterung und enthält Neuronen, Muskel, epithelialen und sekretorischen Zellen13,29. Normalerweise versteckt in einer Tasche an der Bauchseite des Tieres, es erstreckt sich über einzelne Körper des Tieres auf das Vorhandensein von Nahrung sensing öffnen. Um selektiv den Pharynx amputieren, genießen wir Planarien in einer chemischen genannt Natriumazid, eine häufig verwendete Anästhetikum in C. Elegans14,15,16. Seine Verwendung in Planarien wurde erstmals berichtet, von Adler Et Al., 2014-12. Innerhalb von Minuten der Exposition gegenüber Natriumazid Planarien extrudieren Sie ihre Pharynges und mit sanften Agitation des Rachens trennt das Tier. Dieser vollständige und selektiven Verlust des Rachens bezeichnen wir als "chemische Amputation". Eine Woche nach der Amputation, ist eine voll funktionsfähige Rachen restaurierten12. Da Rachens für Fütterung erforderlich ist, kann funktionelle Regeneration gemessen werden, durch die Überwachung Fressverhalten. Im folgenden beschreiben wir das Protokoll für chemische Amputation und für die Beurteilung der Regeneration des Rachens und Wiederherstellung der Fressverhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1042">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:204px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:155px;">C79-3</td>
			<td style="width:236px;">Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M65-3</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2)</td>
			<td>Acros/VWR</td>
			<td>41341-5000</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Acros Organics/VWR</td>
			<td>196770010</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Acros Organics/VWR</td>
			<td>207790050</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Acros Organics/VWR</td>
			<td>123360010</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/VWR</td>
			<td>2324-0015</td>
			<td>Storing planaria water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Planaria water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Planaria water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71970</td>
			<td>Mincing liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pastry bags-16&#8221;, 12 pack</td>
			<td>Wilton</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Liver aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL syringes</td>
			<td>BD/VWR</td>
			<td>309647</td>
			<td>Liver aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes-35mm/60mm</td>
			<td>Greiner Bio-One/VWR</td>
			<td>82050-536/82050-544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic containers (various sizes)</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Housing planarians in static culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>138030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps - Dumont Tweezer, Style 5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>72700-D (0203-5-PO)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical amputation and regeneration of the pharynx in the planarian schmidtea mediterranea

Planarien sind Plattwürmer, die äußerst effizient auf Regeneration. Sie verdanken diese Fähigkeit, eine große Anzahl von Stammzellen, die auf jeder Art von Verletzungen schnell reagieren können. Häufige Verletzungen Modelle in diesen Tieren entfernen Sie große Mengen von Gewebe, die mehrere Organe schädigt. Um dieses breite Gewebeschäden zu überwinden, beschreiben wir hier eine Methode, um gezielt ein einzelnes Organ, des Rachens in die Planarian Schmidtea Mediterraneaentfernen. Dies erreichen wir durch Einweichen Tiere in eine Lösung mit der Cytochrom-Oxidase-Hemmer Natriumazid. Kurze Exposition gegenüber Natriumazid verursacht Extrusion des Rachens vom Tier, nennen wir "chemische Amputation." Chemischen Amputation entfernt den gesamten Rachenraum und erzeugt eine kleine Wunde, wo der Pharynx in den Darm legt. Nach umfangreichen spülen, regeneriert alle Amputierte Tieren eine voll funktionsfähige Rachen in etwa einer Woche. Stammzellen in den Rest des Körpers fahren Regeneration des neuen Rachens. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum chemischen Amputation und histologische und Verhaltensstörungen Methoden zur Beurteilung der erfolgreichen Amputation und Regeneration zu beschreiben.

Exposition gegenüber Natriumazid stört die normale Beweglichkeit der Planarien, Tiere zu dehnen und Winden verursacht. Diese Bewegungen zwingen den Rachen von der ventralen Seite des Tieres entstehen, und nach ca. 6 min. in Natrium-Azid-Lösung, die weiße Spitze des Rachens zu sehen (Abbildung 1 b-linken). Ein paar Minuten später, Tiere aktiv zusammenziehen und des Rachens durch Drücken Sie ihn gewaltsam aus dem Körper vollständig zu e...

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Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Das Planarian Schmidtea Mediterranea ist ein hervorragendes Modell für das Studium Stammzellen und Regeneration des Gewebes. Diese Publikation beschreibt eine Methode, um ein Organ, des Rachens, selektiv zu entfernen, indem man Tiere, die chemische Natriumazid. Dieses Protokoll beschreibt auch Methoden für die Überwachung des Rachens Regeneration.

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

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Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

10.6K Aufrufe.  Cornell University. Das Planarian Schmidtea Mediterranea ist ein hervorragendes Modell für das Studium Stammzellen und Regeneration des Gewebes. Diese Publikation beschreibt eine Methode, um ein Organ, des Rachens, selektiv zu entfernen, indem man Tiere, die chemische Natriumazid. Dieses Protokoll beschreibt auch Methoden für die Überwachung des Rachens Regeneration.

Serie: Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Untersuchung von Blut Zellpopulationen des<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. This morphological alteration is also recognized as epithelial to mesenchymal transition (EMT). Dysregulation of EMT is associated with fibrosis and cancer metastasis. There is emerging evidence that EMT is controlled by a number of molecular mechanisms. As such, many key genes that control apical constriction are also known to be important factors in the EMT observed in cancer metastasis. Like EMT during Drosophila gastrulation, epithelial cells can be induced to change their shape and be reprogrammed to redirect cell fate towards various other cell types. Here we provide a robust imaging method of Drosophila gastrulation to assay the initiation of morphogenetic cellular movements and cell fate identification during this stage of embryonic development. Using this method, we identify cell rearrangement at the time of gastrulation and demonstrate the importance of apical constriction during gastrulation using GFP labeled DE-cadherin.

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

Bildgebung von Zell-Form-Veränderung und Bewegung der Zellen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gastrulation Mit DE-Cadherin Reporter Transgene Flies

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes von Ratten zur Differenzierung in insulinproduzierende Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...