우리는 감사 알 산체스 알 바로, 초기 최적화 및이 기술 개발을 지원 하 고 싶습니다. 캐롤 린 애 들러의 실험실에 일 코넬 대학 시작 기금에 의해 지원 됩니다.

1입니다. 준비
<ol><li>
Planaria 물 준비 17<ol>
<li>1 X Montjuïc 소금 솔루션에서 planarians을 유지 관리 합니다. 준비 planarian 물, 개별 재고 솔루션 1 M CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl과 초순에 5 M NaCl을 확인 합니다. 필터-0.2 µ m 병 맨 filterfor 장기 저장과 소독. 참고: (25 ° C에서 18.2 m ω의 저항)와 초순 이온을 제거 된 물만을 사용 하 여 준비 계곡이 소금.</li>
		<li>5 X 소금 솔루션의 1 리터 재고를 준비 하려면 1 M CaCl2, 1m MgSO4, MgCl2, KCl과 900 mL 초순에 5 M NaCl 솔루션의 1.6 mL 0.5 mL의 0.5 mL의 5 mL의 5 mL을 결합 합니다. 이 솔루션에 NaHCO3 0.504 g를 추가 하 고 섞어 저 어. 염 산 7.0에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>두이 일 농도 대용량 유리병 등 무 균 용기에 초순에 X 1 재고 솔루션 배 희석 ( 재료의 표참조). 이 1 배 솔루션을 사용 하 여 성별이 없는 planarians를 유지 하기 위한. 참고: 계곡이 소금 솔루션, 사용 하 여 로컬로 구입한 봄 물 또는 상용 수족관 소금 포함 된 초순 농도 of0.5 g/L18( 재료의 표참조)를 혼합.</li>
		<li>정적 문화19에 세균 감염을 방지 하기 위해 항생제를 포함 하는 물에서 planarians을 유지 관리 합니다. 50 mg/mL 초순에 gentamicin 황산의 재고 솔루션을 준비 하 고 필터를 소독. 동물 유지는 컨테이너, gentamicin 황산 50 µ g/mL (1:1000 희석)의 최종 농도에 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
간 붙여넣기의 준비
	<ol>
<li>Planarians 유기의 다이어트에 성공할 풀을 먹이 쇠고기 간, 구매 신선한 간 고 24 h. 프로세스 제거 부드럽게 벗 여 간 캡슐화 막 캡슐. 간 ~ 1 cm 조각으로 잘라 하 고 블레이드를 사용 하 여 다쳤어요을 모든 간 정 맥과 동맥을 삭제.</li>
		<li>Macerate 간 조각 음식 밀 또는 푸드 프로세서를 사용 하 고 와이어 메쉬 음식 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 과자 봉지에 결합 하 고 주사기 또는 35 mm 페 트리 접시로 분배. 수 유, 전에 기포 제거를 부드럽게 원심.</li>
		<li>간 1 년 및 이전에 사용 하 여 해 동-80 ° C에서의 aliquots를 저장 합니다. 녹고, 후 다시 한 번, 어떤 남은 간 동결 또는 24 h까지 4 ° C에서 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
동물의 유지 보수
	<ol>
<li>Planarians는 성장 하 고 먹이 기의 주파수에 따라 다양 한 크기로 축소 됩니다. 피드 planarians 모든 다른 주 (14 일에 한 번). 장기적인 대량 문화에 대 한 ( 재료의 표참조) 다양 한 크기의 플라스틱 용기를 사용 합니다.</li>
		<li>동물 먹이 상자에 간 한 완두콩 크기의 방울을 배치 하는 금속 주걱 또는 플라스틱 전송 피펫으로 사용 합니다. 동물 상자를 청소 하기 전에 1-2 헤 제거 나머지 음식 먹을 수 있습니다.</li>
		<li>먹이 하지 않을 경우 벌레 먹이 (직접 수 유 후 한 번 그리고 한 번 2 일 후), 면 주 2 회 또는 주 1 회 청소. 청소, 상자에서 planarians를 유지 하면서 신중 하 게 물을 붓는 의해 플라스틱 비 커에 물을 드레인. 상자 표면 종이 타월로 닦아 다음 상자는 깨끗 한 때까지 모든 면에서 반복.</li>
		<li>물 (약 ¾ 상자 볼륨)를 장착 하 고 50 µ g/mL의 최종 농도에 gentamicin 추가. 어두운 캐비닛에 또는 20 ° C 배양 기에서 동물을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
벌레의 선택
	<ol>
<li>5-7 일 이전 지 루 했다 벌레를 선택 합니다. 참고: 그것은 훨씬 더가 최근 (1-2 일전 절단) 먹이 벌레에서 pharynges 절단 어렵다. 먹이 동물 또한 더에 민감합니다 나트륨 아 지 드.</li>
		<li>벌레는 약 6 m m 길이 선택 합니다. 벌레의 크기를 예측 하려면 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여 배양 접시에 그것을 전송. 플랫 6-에서 눈금자 또는 페 트리 접시 아래 5 x 5 mm 방안 놓고 그것을 크롤 링 하는 동안 벌레 길이 측정 합니다. 참고: 길이 6 m m 보다 작은 벌레는 절단 하기 더 어렵다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
나트륨 아 지 드의 준비
	<ol>
<li>나트륨 아 지 드 가루 planaria 물에 용 해 하 여 100 m m 솔루션을 준비 합니다. 주의: 나트륨 아 지 드 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다. 나트륨 아 지 드 구로 버리지 마십시오. 다음 사용 하 여, 개별적으로 유해 폐기물 처리에 대 한 수집.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 인 두 절단
<ol><li>장소는 직경 35 mm 페 트리 접시에에서 벌레. 조심 스럽게 플라스틱 전송 피펫으로 사용 하 여 접시에서 모든 planarian 물 제거. 참고: 20 6 mm 웜 최대이 크기의 접시에 편안 하 게 가질 수 있습니다.</li>
	<li>현미경 아래 접시를 놓고 여러 벌레를 동시에 볼 수 있도록 확대 조정 (예: 10 배 확대). 100mm 나트륨 아 지 드 솔루션에 planarian 물을 바꿉니다. 참고: 35 mm 페 트리 접시, 나트륨 아 지 드의 약 5 mL는 충분 합니다. 솔루션에는 planarians 잠수함 완전히 한다. 필요에 따라 더 큰 접시를 위한 솔루션 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>현미경 및 이동 하는 첫 번째 3-4 분 요리에서 후 렴에서 동물을 모니터링 합니다.</li>
	<li>인 두의 돌출; 현미경을 통해 관찰 인 두 인 두 주머니에서 밀려 나 되며 완전히 확장 (길이 약 1 m m) 그림 1B와 같이. 참고: 그것은 인 두 더 진행 하기 전에 완전히 확장 완료 될 때까지 대기 하는 것이 중요입니다. 인 두는 동물에서 나온다, 일단 전체 확장 약 1 분 걸립니다.</li>
	<li>사용 하 여 플라스틱 전송 피펫으로 접시 주위 동물 물 총. 피펫으로에 동물을 빨 아 하 고 강제로 그들을 풀어 접시에 몇 번. 이 활기찬 pipetting 인 두 완전히 확장, 분리를 발생 합니다.</li>
	<li>그림 1C와 같이 또는 그것의 길이 따라 세로 또는 가로로 미세 집게 ( 재료의 표참조)의 쌍을 사용 하 여 그것의 둘레에 따라 인 두를 파악. 집게에 슬쩍 하는 인 두와 함께 위쪽으로 초승달 모양으로 동물을 들어올립니다. 동물 발생으로 표면 장력 동물 로부터 분리 하 인 두를 발생 합니다. 참고: 강력한 소용돌이 없는 적절 한 작은 동물 (1-3 m m 길이)의 pharynges를 제거 하려면이 메서드를 사용할 수 있습니다. 파고 또는 다른 동물의 신체 부상 하지 마십시오.</li>
	<li>전송 피펫으로 사용 하 여 신선한 planaria 물을 포함 하는 새로운 요리를 절단된 동물을 이동 합니다.</li>
	<li>일단, 절단된 동물 planaria 물, 완전히 교환 물 세 번에 철저 하 게 린스. Gentamicin의 50µg/mL와 planaria 물을 포함 하는 새로운 접시에 전송. 참고: 이러한 세 가지 세척 하는 동안 완전 한 버퍼 교환 나트륨 아 지 드의 제거를 위해 필수적입니다.</li>
	<li>다음 날, 신선한 planaria 물 gentamicin의 50 µ g/mL를 포함 하는 접시에 물을 바꿉니다. 그 후 모든 다른 일을 반복 합니다.</li>
</ol>3입니다. 절단 후 인 두 제거의 평가
<ol><li>그림 2A와 같이 어두운 장소는 인 두의 성공적인 제거 후 등장 했다 여부 결정 (10-20 배 확대)와 현미경 동물을 검사 합니다.</li>
	<li>또는, 수정 하 고 표 백제 피어슨 연구진이 설명 하는 프로토콜에 따라 동물 20. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 streptavidin 붙일 활용에 하룻밤 담가 동물 (1 mg/mL 희석 1: 500 X 0.3%를 포함 하는 인산 염 Buffered 염 분 1에 트리톤 X). 80% glycerol/20% 1 X 인산 Buffered 염 분 및 형광 stereomicroscope (그림 2B) 아래 이미지에에서 슬라이드에 동물을 탑재 합니다. 참고: 이 원고에 있는 모든 이미지는 1.0 X 목적으로 형광 stereomicroscope에 체포 했다.</li>
</ol>4. 먹이 행동을 측정 하 여 인 두 중생의 평가
<ol><li>
간의 준비
	<ol>
<li>Microcentrifuge 또는 원뿔 튜브로 간 붙여넣기의 필요한 수량을 전송 합니다. 짧게 공기 방울을 제거 하려면 회전. 간, 양을 견적 하 고 그 볼륨의 1/5와 빨간 식용 색소의 총 볼륨의 2 %planaria 물 추가. 예를 들어 1000 µ L 간 붙여넣기를 planaria 물 200 µ L 24 µ L의 식용 색소를 추가 합니다.</li>
		<li>Using 플라스틱 유 봉, 피 펫 팁 또는 금속 주걱, 식용 색소는 간 붙여넣기에 고르게 분포 되어 때까지 철저 하 게 혼합. 다시 짧게 스핀. 간 붙여넣기 24 h 4 ° C에서 저장 하거나 장기 저장을 위한-80 ° C에서 aliquots에 동결 될 수 있습니다.</li>
		<li>최대 25 동물 테스트, 접시 (약 1 µ L 당 동물 간 붙여넣기의) 당 간 붙여넣기의 25 µ L를 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
동물 먹이
	<ol>
<li>화학 절단 후 7 일 새로운 배양 접시에 동물을 전송. 10-15 동물 테스트를 사용 하 여 35mm 접시; 15 동물 60 mm 페 트리 접시에 시험 되어야 한다. 어둠 속에서, 그대로, 약 1 시간 전에 수 유에 대 한 동물을 유지.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여, 좁은 엔드의 ½ cm 대략 트리밍에 의해 P200 피 펫 팁의 너비를 늘립니다. 피펫으로 25 µ L의 접시에 빨간 간 붙여넣기. 참고: 트리밍 끝 pipetting 점성 간 붙여넣기 쉽게 만든다. 간 표면에 떠 있는 않도록 분배 하는 동안 접시의 바닥에 팁을 터치 합니다.</li>
		<li>30 분 동안 먹을 동물을 수 있습니다.</li>
		<li>흰색 바탕에 동물을 배치 하거나 10-20 배 확대 현미경 아래에서 그들을 검토 하 여 먹은 동물의 수를 점수.</li>
		<li>수 유, 후 간 접시에서 제거 하 고 청소 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+and+Cellular+Choreography+of+Appendage+Regeneration.">The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration.</a> Cell. 165, 1598-1608 (2016).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).</li><li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish.">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62, 232-240 (2013).</li><li>Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+growth+in+Drosophila+imaginal+discs+is+regulated+by+Wingless+and+Myc.">Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc.</a> Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).</li><li>Smith-Bolton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Imaginal+Discs+as+a+Model+of+Epithelial+Wound+Repair+and+Regeneration.">Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration.</a> Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).</li><li>Newmark, P. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+your+father's+planarian:+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics.">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).</li><li>Reddien, P. W., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration.">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li><li>Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoblast+specialization+in+regeneration+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).</li><li>van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+reveals+functionally+distinct+classes+within+the+planarian+stem+cell+compartment.">Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment.</a> Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).</li><li>Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+amputation+of+the+pharynx+identifies+a+FoxA-dependent+regeneration+program+in+planaria.">Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria.</a> Elife. 3, e02238 (2014).</li><li>Adler, C. E., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHRED-1+is+a+divergent+neurexin-1+homolog+that+organizes+muscle+fibers+and+patterns+organs+during+regeneration.">PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration.</a> Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).</li><li>Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+using+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system.">Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system.</a> Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C+elegans+chemotaxis+assay.">C elegans chemotaxis assay.</a> J. Vis. Exp. , e50069 (2013).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).</li><li>Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Stem+Cell+Motility+In+Vivo+Based+on+Immunodetection+of+Planarian+Neoblasts+and+Tracing+of+BrdU-Labeled+Cells+After+Partial+Irradiation.">Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation.</a> Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).</li><li>Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+screen+in+planarians+reveals+regulators+of+whole-brain+regeneration.">A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Arnold, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+shifts+in+endogenous+microbiota+impede+tissue+regeneration+via+distinct+activation+of+TAK1/MKK/p38.">Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians.">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li><li>LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+Absence+Does+Not+Regulate+Planarian+Stem+Cells+during+Eye+Regeneration.">Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration.</a> Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dopaminergic+neurons+after+6-hydroxydopamine-induced+lesion+in+planarian+brain.">Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain.</a> J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).</li><li>Wilson, D. F., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azide+inhibition+of+mitochondrial+electron+transport.+I.+The+aerobic+steady+state+of+succinate+oxidation.">Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).</li><li>Duncan, H. M., Mackler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Transport+Systems+of+Yeast:+III.+Preparation+and+properties+of+cytochrome+oxidase.">Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).</li><li>Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-specific+composition,+assembly+and+kinetics+of+stress+granules+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+nervous+system+in+the+model+planarian+Schmidtea+mediterranea:+An+immunocytochemical+study.">Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study.</a> Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).</li><li>Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Neuropeptide-Coding+Genes+Involved+in+Planarian+Pharynx+Extension.">Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension.</a> Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).</li><li>Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphic+regeneration+of+the+distal+part+of+the+planarian+pharynx.">Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx.</a> Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).</li><li>Bueno, D., Espinosa, L., Bagu&#241;&#224;, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+pharynx+regeneration+in++tail+fragments+monitored+with+cell-specific+monoclonal+antibodies.">Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies.</a> Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).</li><li>Hyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 나트륨 아 지 드를 사용 하 여 인 두의 선택적 절제 하는 방법을 설명 합니다. Planarians에 다른 대상된 제거 연구 대뇌21 또는 약리 치료 dopaminergic 신경22ablate을 제거 하려면 수정된 수술을 사용 했습니다. 기존 방법에 비해 화학 절단의 중요 한 장점 중 하나입니다 그것은 수술을 요구 하지 않습니다. Planarian 시체의 나머지 부분에 비해 인 두의 경직 ?...

재생 재생 용량 전신 재생 특정 무척 추 동물에서에서 척추1에서 더 제한 된 능력에 이르기까지 동물의 왕국에 걸쳐 발생 하는 현상입니다. 교체 기능 조직의 복잡 한 과정이 고 종종 여러 종류의 세포 동시 복원을 수반 한다. 예를 들어 도롱뇽 다리, osteoblasts, chondrocytes, 신경, 근육, 그리고 될 필요가 상피 세포를 다시 생성 하려면2를 대체 합니다. 이 새로 생성 된 셀 형식 또한 새로운 다리 기능을 촉진 하기 위하여 제대로 구성 해야 합니다. 이러한 복잡 한 프로세스를 이해 기법을 재생 특정 세포 유형 및 기관으로의 통합에 초점을 해야 합니다.
재생 반응의 연구를 단순화 하기 위해 고용 전략 중 하나입니다 대상된 제거 중 특정 종류의 세포 또는 조직의 더 큰 컬렉션. 예를 들어 zebrafish, 표현의 특정 셀에 nitroreductase 그들의 파괴 후에 metronidazole3,4의 응용 프로그램을 리드. 초파리 애벌레에서 조직의 특정 발기인에서 프로-apoptotic 유전자 표현 imaginal 디스크5,6의 특정 지역 ablate 선택적으로 수 있습니다. 모두 이러한 전략의 손상을 신속 하지만 제어, 그리고 분자 및 세포 재생에 대 한 책임 메커니즘을 해 부에 사용 되었습니다.
이 원고에서 우리는 선택적으로 ablate planarian Schmidtea 서인 두 라는 전체 장기 하는 방법을 설명 합니다. Planarians는 그들의 다 작의 재생 능력에 대 한 알려진 중생의 클래식 모델도 분 조각 전체 동물 7,8을 regrow 수 있습니다. 그들은 줄기 세포를 만능 세포와 혈통 제한 창시자9,,1011의 구성의 큰, 이질적인 인구가 있다. 이 세포는 증식 하 고 인 두, 신경, 소화 및 배설 시스템, 그리고 근육과 상피 세포9,,1012를 포함 하 여 모든 누락 된 조직을 대체 하 차별화 합니다. 우리가 알고 있지만 이러한 줄기 세포 재생을 시작, 우리가 완전히 이러한 모든 다른 세포 유형 대체 몰아 분자 메커니즘을 이해 하지 않습니다. 정확한 줄기 세포 응답을 이끌어내는 정의 부상 방법이 복잡 한 과정의 윤곽을 그리 다 수 있습니다.
인 두, 수 유에 필요한 대형 원통형 튜브 이며, 신경, 근육, 분 비 상피 세포13,29를 포함 합니다. 일반적으로 동물의 복 부 측에 주머니에 숨겨져, 동물의 단일 신체 식품의 존재를 감지 시 열기를 통해 확장 합니다. 선택적으로 인 두를 절단, 하 우리 라는 화학 나트륨 아 지 드, 선 충 C.14,,1516에 일반적으로 사용된 마 취에서에서 planarians를 담근 다. Planarians에 그것의 사용 처음 애 들러 외에 의해 보고 되었다., 2014 년12. 나트륨 아 지 드에 노출의 몇 분 안에 planarians 돌출 그들의 pharynges, 그리고 부드러운 동요와 인 두 동물에서 분리. 우리는 인 두의이 완전 하 고 선택적 손실 "화학 절단"로 참조 하십시오. 1 주일 후 절단, 완전 한 기능 인 두 복원된12입니다. 인 두 먹이 기를 위해 필요 하기 때문에, 기능 재생 먹이 행동을 모니터링 하 여 측정할 수 있습니다. 아래, 우리는 화학 절단 및 인 두의 재생 및 복원의 먹이 행동을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1042">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:204px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:155px;">C79-3</td>
			<td style="width:236px;">Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M65-3</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2)</td>
			<td>Acros/VWR</td>
			<td>41341-5000</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Acros Organics/VWR</td>
			<td>196770010</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Acros Organics/VWR</td>
			<td>207790050</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Acros Organics/VWR</td>
			<td>123360010</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/VWR</td>
			<td>2324-0015</td>
			<td>Storing planaria water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Planaria water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Planaria water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71970</td>
			<td>Mincing liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pastry bags-16&#8221;, 12 pack</td>
			<td>Wilton</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Liver aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL syringes</td>
			<td>BD/VWR</td>
			<td>309647</td>
			<td>Liver aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes-35mm/60mm</td>
			<td>Greiner Bio-One/VWR</td>
			<td>82050-536/82050-544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic containers (various sizes)</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Housing planarians in static culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>138030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps - Dumont Tweezer, Style 5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>72700-D (0203-5-PO)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical amputation and regeneration of the pharynx in the planarian schmidtea mediterranea

Planarians는 flatworms는 중생에서 매우 효율적인. 그들은 빚이 수 많은 부상의 모든 종류에 신속 하 게 응답할 수 있는 줄기 세포. 이 동물에 일반적인 부상 모델 조직, 여러 장기를 손상의 다량을 제거 합니다. 극복 하기 위해이 광범위 한 조직 손상, 여기 planarian Schmidtea 지중해에서 단일 기관, 인 두를 선택적으로 제거 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 시 토 크롬 산화 효소 억제제 나트륨 아 지 드를 포함 하는 솔루션에 몸을 담글 동물에 의해 이것을 달성. 나트륨 아 지 드에 짧은 노출 우리가 "화학 절단" 이라고 부르는 동물에서 인 두의 돌출을 하면 화학 절단 전체 인 두를 제거 하 고 작은 상처 인 두 소장에 연결을 생성 합니다. 광범위 한 rinsing 후 모든 절단된 동물 약 1 주일에서 완전 한 기능 인 두를 다시 생성 합니다. 줄기 세포는 시체의 나머지 부분에서 새로운 인 두의 재생 드라이브. 여기, 우리는 자세한 제공 화학 절단에 대 한 프로토콜 및 성공적인 절단 및 중생을 평가 하기 위해 조직학 및 행동 방법을 설명.

나트륨 아 지 드에 노출 동물 스트레칭 하 고 몸부림을 일으키는 planarians의 정상적인 운동 성 방해. 이러한 움직임은 동물의 복 부 측에서 등장 하는 인 두 고 나트륨 아 지 드 솔루션에서 약 6 분, 후 인 두의 흰색 팁을 볼 수 있다 (그림 1B-왼쪽된 패널). 몇 분 후, 동물 적극적으로 계약 하 고 완전히 몸 밖으로 강제로 그것을 추진 하 여 인 ...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea at JoVE.com

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

화학 절단 및 Planarian Schmidtea 지중해 에 인 두의 재생

Schmidtea 서 planarian 줄기 세포 및 조직 재생을 공부에 대 한 우수한 모델입니다. 이 게시는 선택적으로 한 기관, 인 두, 화학 나트륨 아 지 드를 동물을 노출 하 여 제거 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 또한 인 두 재생을 모니터링 하기 위한 방법을 설명 합니다.

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

chemical-amputation-regeneration-pharynx-planarian-schmidtea

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

10.6K 조회수.  Cornell University. Schmidtea 서 planarian 줄기 세포 및 조직 재생을 공부에 대 한 우수한 모델입니다. 이 게시는 선택적으로 한 기관, 인 두, 화학 나트륨 아 지 드를 동물을 노출 하 여 제거 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 또한 인 두 재생을 모니터링 하기 위한 방법을 설명 합니다.

비디오: Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

연구

발생학

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도<em&gt; Nematostella의 vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. This morphological alteration is also recognized as epithelial to mesenchymal transition (EMT). Dysregulation of EMT is associated with fibrosis and cancer metastasis. There is emerging evidence that EMT is controlled by a number of molecular mechanisms. As such, many key genes that control apical constriction are also known to be important factors in the EMT observed in cancer metastasis. Like EMT during Drosophila gastrulation, epithelial cells can be induced to change their shape and be reprogrammed to redirect cell fate towards various other cell types. Here we provide a robust imaging method of Drosophila gastrulation to assay the initiation of morphogenetic cellular movements and cell fate identification during this stage of embryonic development. Using this method, we identify cell rearrangement at the time of gastrulation and demonstrate the importance of apical constriction during gastrulation using GFP labeled DE-cadherin.

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

셀 모양 변경 허가 및 세포 운동에서의 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 낭배 사용 DE-cadherin의 기자 형질 전환의 파리

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Stentor 에 중생의 연구 방법

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

성인 마우스 숫자 절단 및 재생 : 포유류 블라스터 마 형성 및 intramembranous Ossification을 조사하는 간단한 모델

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

인슐린 생성 세포로 분화를 위한 쥐 지방조직 중간엽 줄기세포의 분리

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...