Gostaríamos de agradecer a Alejandro Sánchez Alvarado, que apoiaram a otimização inicial e desenvolvimento desta técnica. Trabalho no laboratório de Carolyn Adler é suportado por fundos de start-up da Universidade de Cornell.

1. preparação
<ol><li>
Preparação da água de planária 17<ol>
<li>Manter a boca em uma solução de sal de X Montjuïc 1. Para preparar Turbellaria água, certifique-se soluções de ações individuais de 1 M CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1m KCl e 5 M NaCl em água ultrapura. Filtro-esterilizar com um armazenamento de longo prazo de garrafa-top filterfor de 0,2 µm. Nota: Use apenas água desionizada ultrapura (com uma resistividade de 18,2 MΩ a 25 ° C) para preparar Montjuïc sais.</li>
		<li>Para preparar um estoque de 1 L de solução de sal de 5 X, combinam-se 5 mL de 1 M CaCl2, 5ml de 1 M MgSO4, 0,5 mL de MgCl2, 0,5 mL de KCl e 1,6 mL das soluções de NaCl 5m em 900 mL de água ultrapura. Para esta solução, adicionar 0,504 g de NaHCO3 e mexa para misturar. Ajuste o pH a 7,0 com ácido clorídrico.</li>
		<li>Diluir esta 5 X solução estoque para um 1 X concentração de trabalho em água ultrapura em recipiente estéril como um garrafão de grande capacidade (veja a Tabela de materiais). Use esta solução X 1 para manter a boca assexuada. Nota: Como uma alternativa para a solução de sal de Montjuïc, usar água de nascente-comprado localmente ou água ultrapura, contendo um sal de aquário comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) se misturam em uma of0.5 de concentração g/L18.</li>
		<li>Para prevenir a infecção bacteriana em cultura estática19, manter a boca em água contendo um antibiótico. Preparar um 50 mg/mL de solução de sulfato de gentamicina em água ultrapura e filtro-esterilizar. Para recipientes onde os animais são mantidos, adicione sulfato de gentamicina a uma concentração final de 50 µ g/mL (diluição 1: 1000).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de pasta de fígado
	<ol>
<li>Como boca prosperar em uma dieta de orgânicos, fígado, carne grass-fed compra fígado fresco e processo no prazo de 24 h. remover a cápsula membranosa, encapsulando o fígado por descascá-la suavemente. Corte o fígado em cubos de ~ 1 cm e usar uma lâmina para raspar e descartar todas as artérias e veias hepáticas.</li>
		<li>Macerar pedaços de fígado usando uma fábrica de alimentos ou um processador de alimentos e passá-lo através de um filtro de comida de malha de arame. Combinar em sacos de pastelaria e dispense em seringas ou 35mm placas de Petri. Antes da alimentação, centrifugue suavemente para remover as bolhas de ar.</li>
		<li>Loja alíquotas do fígado a-80 ° C por até um ano e descongelar antes de usar. Após o descongelamento, re-congelar qualquer sobra fígado uma vez, ou armazenar a 4 ° C por até 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Manutenção de animais
	<ol>
<li>Boca vai crescer e encolher de vários tamanhos, dependendo da frequência de alimentação. Alimente a boca toda semana (uma vez a cada 14 dias). Para culturas de massa a longo prazo, use recipientes de plástico de vários tamanhos (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Para alimentar os animais, use uma espátula de metal ou pipeta de transferência plástica para colocar uma gota do tamanho de ervilha de fígado em uma caixa. Permitir que os animais comer por 1-2 h remover alimentos restantes antes de limpar a caixa.</li>
		<li>Limpar os vermes duas vezes por semana se alimentado (uma vez diretamente após a alimentação e uma vez dois dias depois), ou uma vez por semana se não for alimentado. Para limpar, drene a água para um copo de plástico derramando cuidadosamente para fora da água, mantendo a boca na caixa. Limpe a superfície da caixa com uma toalha de papel e, em seguida, repita por todos os lados, até que a caixa está limpa.</li>
		<li>Água (aproximadamente ¾ do volume de caixa) e adicionar gentamicina para uma concentração final de 50 µ g/mL. Loja de animais em um armário escuro ou numa incubadora de 20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seleção de vermes
	<ol>
<li>Selecione os vermes que foram alimentados com 5-7 dias anteriores. Nota: É significativamente mais difícil que amputar pharynges de vermes que foram alimentados recentemente (1-2 dias antes da amputação). Animais alimentados também são mais sensíveis a azida de sódio.</li>
		<li>Selecione os vermes que são aproximadamente 6 mm de comprimento. Para estimar o tamanho do worm, transferi-lo para uma placa de Petri com uma pipeta de transferência plástica. Coloque uma régua plana 6 - em ou papel milimetrado de 5 x 5 mm por baixo da placa de Petri e medir o comprimento de verme, enquanto que rastreia. Nota: Vermes, menores que 6 mm de comprimento são mais difíceis de amputar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de azida de sódio
	<ol>
<li>Prepare uma solução de 100 mM, dissolvendo o pó de azida de sódio em água de planária. Atenção: Azida de sódio é tóxica e deve ser manuseada com cuidado. Não descarte a azida de sódio no ralo. Após a utilização, coletá-lo separadamente para disposição como resíduos perigosos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. faringe amputação
<ol><li>Lugar de vermes em um diâmetro de 35 mm placa de Petri. Retire toda água Turbellaria do prato usando uma pipeta de transferência plástica. Nota: Um máximo de 20 6mm vermes pode ser confortavelmente acomodado em um prato deste tamanho.</li>
	<li>Coloque o prato no microscópio e ajustar a ampliação para que vários vermes podem ser visualizados simultaneamente (por exemplo, 10 ampliação de X). Substitua a água Turbellaria com solução de azida de sódio de 100 mM. Nota: Para um prato de Petri de 35 mm, aproximadamente 5 mL de azida de sódio é suficiente. A solução completamente deve submergir a boca. Ajuste o volume da solução para pratos maiores, se necessário.</li>
	<li>Monitore os animais sob o microscópio e abster-se de mover o prato para o primeiro 3-4 min.</li>
	<li>Observar a extrusão da faringe através do microscópio; a faringe vai sobressair da bolsa faríngea e estender totalmente (cerca de 1 mm de comprimento) como mostrado na figura 1B. Nota: É importante esperar até a faringe terminou estendendo completamente antes de prosseguir ainda mais. Uma vez que a faringe emerge o animal, extensão completa leva cerca de 1 min.</li>
	<li>Use uma pipeta de transferência plástico para esguichar animais ao redor do prato. Sugar os animais para a pipeta e forçosamente liberá-los para o prato duas vezes. Se a faringe é totalmente estendida, este vigoroso pipetagem fará com que a desanexar.</li>
	<li>Como alternativa, segure a faringe verticalmente ao longo de seu comprimento, ou horizontalmente ao longo de sua circunferência usando um par de pinças bem (ver Tabela de materiais) como mostrado na Figura 1. Com a faringe comprimida no fórceps, levante o animal para cima em direção do menisco. Como o animal é criado, tensão superficial fará com que a faringe desanexar do animal. Nota: Esse método pode ser usado para remover os pharynges de animais menores (1-3 mm de comprimento) onde a agitação vigorosa não é adequada. Evite picar ou caso contrário ferir o corpo do animal.</li>
	<li>Usando uma pipeta de transferência, mova animais amputados para um novo prato contendo água fresca planária.</li>
	<li>Uma vez transferido, enxágue amputadas animais completamente em água planária, completamente trocando a água três vezes. Transfira para um prato novo contendo água planaria com 50µg/mL de gentamicina. Nota: Troca de amortecedor completo durante estes três lavagens é essencial para assegurar a remoção de azida de sódio.</li>
	<li>No dia seguinte, substitua a água no prato com água fresca planária contendo 50 µ g/mL de gentamicina. Repetir todos os dias depois disso.</li>
</ol>3. avaliação da remoção da faringe após amputação
<ol><li>Examine os animais sob um microscópio (com ampliação de 10-20 X) para determinar se uma mancha escura apareceu após a remoção bem sucedida da faringe, como mostrado na Figura 2A.</li>
	<li>Alternativamente, corrigir e branquear os animais de acordo com o protocolo descrito por Pearson et al 20. animais de molho durante a noite em 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou estreptavidina conjugado fluorescente (1: 500 1 mg/mL diluído em 1 X solução salina de tampão fosfato contendo 0,3% Triton-X). Monte animais em slides em 80% glycerol/20% 1 X fosfato Buffered Saline e imagem sob um microscópio fluorescente (Figura 2B). Nota: Todas as imagens neste manuscrito foram capturadas em um microscópio fluorescente com um objetivo X 1,0.</li>
</ol>4. avaliação da regeneração da faringe, medindo o comportamento alimentar
<ol><li>
Preparação do fígado
	<ol>
<li>Transferi a quantidade necessária de pasta de fígado para uma microcentrifuga ou tubo cônico. Gire rapidamente para remover as bolhas de ar. Estimar o volume do fígado e em seguida, adicione água planária para 1/5 do seu volume e 2% do volume total de corante alimentício vermelho. Por exemplo, a 1000 µ l do fígado colar, adicionar 200 µ l de água planária e 24 µ l de corante alimentar.</li>
		<li>Usando um pilão de plástico, a ponta da pipeta ou espátula de metal, misture bem até o corante alimentício é uniformemente distribuída na pasta de fígado. Rotação de novo brevemente. Pasta de fígado pode ser armazenada a 4 ° C por 24 horas ou congelada em alíquotas a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
		<li>Se testando até 25 animais, prepare 25 µ l de pasta de fígado por prato (aproximadamente 1 µ l de pasta de fígado por animal).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Alimentação de animais
	<ol>
<li>Sete dias após amputação química, transferi os animais para uma nova placa de Petri. Se o teste de 10-15 animais, use um prato de 35mm; mais de 15 animais devem ser testados em uma placa de Petri 60mm. Manter os animais no escuro, imperturbável, por aproximadamente 1h antes da alimentação.</li>
		<li>Usando a tesoura, aumente a largura da ponta da pipeta P200 por aparar aproximadamente ½ cm fora a extremidade estreita. Pipetar 25 µ l de pasta de fígado vermelha no prato. Nota: Aparar o fim faz pipetagem a pasta de fígado viscosa mais fácil. Para impedir que o fígado flutuando na superfície, toca a ponta para o fundo do prato durante o fornecimento.</li>
		<li>Permitir que os animais se alimente durante 30 min.</li>
		<li>Marca o número de animais que tenham comido por colocar os animais em um fundo branco ou sob um microscópio com ampliação de 10-20 X.</li>
		<li>Após a alimentação, retire o prato de fígado e limpar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+and+Cellular+Choreography+of+Appendage+Regeneration.">The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration.</a> Cell. 165, 1598-1608 (2016).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).</li><li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish.">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62, 232-240 (2013).</li><li>Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+growth+in+Drosophila+imaginal+discs+is+regulated+by+Wingless+and+Myc.">Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc.</a> Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).</li><li>Smith-Bolton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Imaginal+Discs+as+a+Model+of+Epithelial+Wound+Repair+and+Regeneration.">Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration.</a> Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).</li><li>Newmark, P. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+your+father's+planarian:+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics.">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).</li><li>Reddien, P. W., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration.">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li><li>Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoblast+specialization+in+regeneration+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).</li><li>van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+reveals+functionally+distinct+classes+within+the+planarian+stem+cell+compartment.">Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment.</a> Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).</li><li>Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+amputation+of+the+pharynx+identifies+a+FoxA-dependent+regeneration+program+in+planaria.">Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria.</a> Elife. 3, e02238 (2014).</li><li>Adler, C. E., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHRED-1+is+a+divergent+neurexin-1+homolog+that+organizes+muscle+fibers+and+patterns+organs+during+regeneration.">PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration.</a> Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).</li><li>Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+using+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system.">Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system.</a> Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C+elegans+chemotaxis+assay.">C elegans chemotaxis assay.</a> J. Vis. Exp. , e50069 (2013).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).</li><li>Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Stem+Cell+Motility+In+Vivo+Based+on+Immunodetection+of+Planarian+Neoblasts+and+Tracing+of+BrdU-Labeled+Cells+After+Partial+Irradiation.">Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation.</a> Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).</li><li>Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+screen+in+planarians+reveals+regulators+of+whole-brain+regeneration.">A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Arnold, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+shifts+in+endogenous+microbiota+impede+tissue+regeneration+via+distinct+activation+of+TAK1/MKK/p38.">Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians.">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li><li>LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+Absence+Does+Not+Regulate+Planarian+Stem+Cells+during+Eye+Regeneration.">Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration.</a> Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dopaminergic+neurons+after+6-hydroxydopamine-induced+lesion+in+planarian+brain.">Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain.</a> J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).</li><li>Wilson, D. F., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azide+inhibition+of+mitochondrial+electron+transport.+I.+The+aerobic+steady+state+of+succinate+oxidation.">Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).</li><li>Duncan, H. M., Mackler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Transport+Systems+of+Yeast:+III.+Preparation+and+properties+of+cytochrome+oxidase.">Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).</li><li>Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-specific+composition,+assembly+and+kinetics+of+stress+granules+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+nervous+system+in+the+model+planarian+Schmidtea+mediterranea:+An+immunocytochemical+study.">Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study.</a> Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).</li><li>Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Neuropeptide-Coding+Genes+Involved+in+Planarian+Pharynx+Extension.">Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension.</a> Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).</li><li>Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphic+regeneration+of+the+distal+part+of+the+planarian+pharynx.">Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx.</a> Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).</li><li>Bueno, D., Espinosa, L., Bagu&#241;&#224;, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+pharynx+regeneration+in++tail+fragments+monitored+with+cell-specific+monoclonal+antibodies.">Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies.</a> Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).</li><li>Hyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve um método da ablação seletiva da faringe usando a azida de sódio. Outros estudos de ablação alvejado na boca têm usado modificada cirurgia para remover fotorreceptores21 ou tratamento farmacológico para ablação de neurônios dopaminérgicos22. Uma vantagem significativa de amputação química sobre os métodos existentes é que não requer cirurgia. A estrutura rígida da faringe em comparação com o resto do corpo Turbellaria facilita a ...

Regeneração é um fenômeno que ocorre em todo o reino animal, com capacidades regenerativas de regeneração de corpo inteiro em certos invertebrados para habilidades mais restritas em vertebrados1. Substituição de tecidos funcionais é um processo complexo e muitas vezes implica a restauração simultânea de vários tipos de células. Por exemplo regenerar o membro salamandra, osteoblastos, condrócitos, neurônios, músculos e células epiteliais precisa ser substituído2. Estes tipos de células recém-gerado também precisam ser organizado corretamente, para facilitar a nova função de membro. Compreensão destes processos complexos requer técnicas que se concentram na regeneração de tipos específicos de células e a sua integração em órgãos.
Uma das estratégias empregadas para simplificar o estudo das respostas regenerativas é a ablação alvo de certos tipos de célula ou maiores coleções de tecidos. Por exemplo, no zebrafish, expressão de nitroreductase em tipos específicos de células leva à sua destruição após a aplicação de metronidazol3,4. Em larvas de Drosophila , expressar genes pro-apoptotic sob promotores tecido-específica pode seletivamente ablate regiões específicas do disco imaginária5,6. Ambas estas estratégias causam dano rápido mas controlado e têm sido usadas para dissecar os mecanismos moleculares e celulares responsáveis pela regeneração.
Este manuscrito, descrevemos um método para ablate seletivamente um órgão inteiro chamado faringe na Turbellaria Schmidtea mediterranea. Boca é um modelo clássico de regeneração, conhecido por sua capacidade regenerativa prolífica, onde fragmentos mesmo minutos podem regenerar toda animais 7,8. Eles têm uma população grande e heterogênea de células-tronco que consiste de células pluripotentes e restrita a linhagem progenitores9,10,11. Estas células proliferam e se diferenciam para substituir todos os tecidos desaparecidos, incluindo a faringe, sistemas nervosos, digestivos e excretoras e músculo e células epiteliais9,10,12. Enquanto nós sabemos que essas células-tronco iniciar a regeneração, podemos não compreender plenamente os mecanismos moleculares que conduzi-los para substituir todos esses diferentes tipos de células. Definidos métodos ferindo que eliciam respostas precisas células-tronco podem ajudar a delinear este complexo processo.
A faringe é um tubo cilíndrico, grande necessário para a alimentação e contém neurônios, músculos, células epiteliais e secretora13,29. Normalmente escondidos em uma bolsa no lado ventral do animal, que se estende através do único corpo do animal, abrindo em cima sentindo a presença de alimentos. Para seletivamente amputar a faringe, nós mergulhe a boca em uma químico chamado azida sódica, uma anestesia comumente usada em c. elegans14,15,16. Seu uso na boca foi primeiramente relatado por Adler et al., em 2014,12. Em poucos minutos de exposição a azida de sódio, boca extrude seus pharynges, e com agitação suave, faringe desconecta-se do animal. Nos referimos a esta perda completa e seletiva da faringe como "química amputação". Uma semana após a amputação, uma faringe totalmente funcional é restaurado12. Porque a faringe é necessária para a alimentação, regeneração funcional pode ser medida pelo monitoramento do comportamento alimentar. Abaixo, descrevemos o protocolo para amputação de química e para avaliar a regeneração da faringe e restauração do comportamento alimentar.

<table><tbody><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-3</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65-3</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Acros/VWR</td><td>41341-5000</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>196770010</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>207790050</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>123360010</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot</td><td>ThermoFisher Scientific/VWR</td><td>2324-0015</td><td>Storing planaria water</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Spectrum Brands</td><td>Amazon</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-100P</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Mincing liver&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Disposable pastry bags-16&amp;rdquo;, 12 pack</td><td>Wilton</td><td>Amazon</td><td>Liver aliquots</td></tr><tr><td>5 mL syringes</td><td>BD/VWR</td><td>309647</td><td>Liver aliquots</td></tr><tr><td>Petri dishes-35mm/60mm</td><td>Greiner Bio-One/VWR</td><td>82050-536/82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Plastic containers (various sizes)</td><td>Ziploc</td><td>Amazon</td><td>Housing planarians in static culture</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Globe Scientific</td><td>138030</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont Tweezer, Style 5</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>72700-D (0203-5-PO)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-1</td><td></td></tr></tbody></table>

chemical amputation and regeneration of the pharynx in the planarian schmidtea mediterranea

Boca é platelmintos que são extremamente eficientes em regeneração. Eles devem esta capacidade a um grande número de células-tronco que podem responder rapidamente a qualquer tipo de lesão. Modelos de lesões comuns nestes animais remover grandes quantidades de tecido, que danifica a vários órgãos. Para superar este dano de tecido largo, descrevemos aqui um método para remover seletivamente um único órgão, a faringe, na Turbellaria Schmidtea mediterranea. Conseguimos isso por animais de imersão em uma solução contendo o citocromo oxidase inibidor de azida sódica. Breve exposição a azida de sódio provoca extrusão da faringe do animal, que chamamos de "amputação química." Amputação química remove a faringe inteira e gera uma pequena ferida onde a faringe anexa para o intestino. Após enxaguar extensa, todos os animais amputados regeneram uma faringe totalmente funcional em cerca de uma semana. Células-tronco no resto do corpo conduzir a regeneração da faringe nova. Aqui, nós fornecemos um detalhado protocolo para amputação de química e descrever métodos histológicos e comportamentais para avaliar o sucesso amputação e regeneração.

Exposição a azida de sódio interrompe a motilidade normal da boca, fazendo com que os animais se esticar e se contorciam. Estes movimentos forçar a faringe que emergem do lado ventral do animal, e após aproximadamente 6 min em solução de azida de sódio, a ponta branca da faringe pode ser vista (figura 1B-painel esquerdo). Poucos minutos depois, os animais ativamente contraem e estendem totalmente a faringe, empurrando-o com força for...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea at JoVE.com

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Química amputação e regeneração da faringe nos Turbellaria mediterranea Schmidtea

A Turbellaria mediterranea Schmidtea é um excelente modelo para o estudo de células-tronco e regeneração de tecidos. Esta publicação descreve um método para remover seletivamente um órgão, a faringe, expondo os animais para a química de azida sódica. Este protocolo também descreve métodos para monitorar a regeneração da faringe.

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

chemical-amputation-regeneration-pharynx-planarian-schmidtea

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K visualizações.  Cornell University. A Turbellaria mediterranea Schmidtea é um excelente modelo para o estudo de células-tronco e regeneração de tecidos. Esta publicação descreve um método para remover seletivamente um órgão, a faringe, expondo os animais para a química de azida sódica. Este protocolo também descreve métodos para monitorar a regeneração da faringe.

Vídeo: Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ensaiando populações de células do sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Biologia do Desenvolvimento

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induzindo completa Polyp Regeneração do aboral Physa da Anémona Starlet<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

Um ensaio planário de motilidade para medir as propriedades biomodulantes de produtos naturais

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Bioquímica

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Biologia

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Planarian Scrunching como uma leitura comportamental quantitativa para sensoriamento de estímulos nocivos

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Planarian Ovary Dissection for Ultrastructural Analysis and Antibody Staining

Accessibility to germ cells allows the study of germ cell development, meiosis, and recombination. The sexual biotype of the freshwater planarian, Schmidtea mediterranea, is a powerful invertebrate model to study the epigenetic specification of germ cells. Unlike the large number of testis and male germ cells, planarian oocytes are relatively difficult to locate and examine, as there are only two ovaries, each with 5-20 oocytes. Deeper localization within the planarian body and lack of protective epithelial tissues also make it challenging to dissect planarian ovaries directly. 
This protocol uses a brief fixation step to facilitate the localization and dissection of planarian ovaries for downstream analysis to overcome these difficulties. The dissected ovary is compatible for ultrastructural examination by transmission electron microscopy (TEM) and antibody immunostaining. The dissection technique outlined in this protocol also allows for gene perturbation experiments, in which the ovaries are examined under different RNA interference (RNAi) conditions. Direct access to the intact germ cells in the ovary achieved by this protocol will greatly improve the imaging depth and quality and allow cellular and subcellular interrogation of oocyte biology.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissecção de ovário planário para análise ultraestrutural e coloração de anticorpos

This protocol presents steps taken to dissect ovaries in the freshwater planarians, Schmidtea mediterranea. The dissected ovaries are compatible for antibody immunostaining and ultrastructural analysis with transmission electron microscopy to study the cell biology of the oocytes and somatic cells, providing an imaging depth and quality that were previously inaccessible.

Química amputação e regeneração da faringe nos Turbellaria mediterranea Schmidtea

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Ensaiando populações de células do sangue

Induzindo completa Polyp Regeneração do aboral Physa da Anémona Starlet