Alejandro Sánchez Alvarado, ilk iyileştirme ve geliştirme bu tekniğin desteklenen teşekkür etmek istiyorum. Carolyn Adler'in laboratuvar çalışmalarında Cornell Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklenir.

1. hazırlık
<ol><li>
Planarialar su hazırlanması 17<ol>
<li>Planarians 1 X Montjuïc tuz solüsyonu içinde korumak. Planarian su hazırlamak için bireysel hisse senedi 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl ve çözümleri ultrasaf su içinde 5 M NaCl olun. Filtre-0.2 µm şişe-üst filterfor uzun süreli depolama ile sterilize. Not: Montjuïc tuzları hazırlamak için sadece ultrasaf deiyonize su (bir direnci 18,2 MΩ 25 ° c) kullanın.</li>
		<li>5 X tuz solüsyonu 1 L stokunun hazırlamak için 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, MgCl2, 0.5 mL KCl ve 5 M NaCl çözümleri 900 mL ultrasaf su 1.6 mL 0.5 mL 5 mL 5 mL birleştirir. Bu çözüm için NaHCO3 0,504 g ekleyin ve karışımı ilave edin. PH hidroklorik asit ile 7.0 için ayarlayın.</li>
		<li>Bu 5 X 1 X çalışma konsantrasyonu ultrasaf su geniş kapasite damacana gibi steril bir kap içinde hisse senedi çözüm seyreltik ( Tablo reçetesigörmek). Bu 1 X çözüm eşeysiz planarians korumak için kullanın. Not: Montjuïc tuz solüsyonu alternatif, yerel olarak satın alınan kaynak suyu veya ultrasaf su piyasada akvaryum tuz içeren kullanın (bkz. Tablo malzeme) bir konsantrasyon of0.5 g/L18karıştırın.</li>
		<li>Statik kültür19bakteriyel enfeksiyonu önlemek için bir antibiyotik içeren suda planarians korumak. 50 mg/mL stok çözüm gentamisin sülfat ultrasaf su hazırlamak ve filtre sterilize. Nerede hayvanlar korunur kaplarına gentamisin sülfat 50 µg/mL (1: 1000 seyreltme) son bir konsantrasyon için ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Karaciğer Yapıştır hazırlanması
	<ol>
<li>Planarians organik bir diyete gelişmek gibi çim beslenen sığır eti karaciğer, satın alma taze karaciğer ve işlemi 24 h içinde kaldırmak yavaşça soyulmuştu tarafından karaciğer Kapsüllenen zar kapsül. Karaciğer ~ 1 cm küpler halinde kesilmiş ve kapalı kazımak ve tüm hepatik damarları ve arterler atmak için bir bıçak kullanın.</li>
		<li>Karaciğer adet gıda fabrikası veya mutfak robotu kullanarak macerate ve sonra bir tel kafes gıda süzgeç aracılığıyla geçer. Hamur işi çanta birleştirmek ve şırınga veya 35 mm Petri yemekler dağıtmak. Besleme önce yavaşça hava kabarcıkları kaldırmak için santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Aliquots karaciğer için-80 ° c en çok bir yıl ve kullanmadan önce tezcan saklayın. Çözdürme sonra artık herhangi bir karaciğer bir kez yeniden dondurma veya en fazla 24 saat için 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hayvan bakım
	<ol>
<li>Planarians büyüyecek ve çeşitli boyutlarda bağlı olarak besleme frekans daraltmak. Planarians her hafta (14 günde bir kez) besleme. Uzun vadeli toplu kültürler, irili ufaklı ( Tablo malzemelerigörmek) plastik kaplar kullanın.</li>
		<li>Hayvanları beslemek için bir metal spatula veya plastik transfer damlalıklı bir kutu içinde bir bezelye büyüklüğünde damla karaciğer eklemenizi sağlar. Hayvanlar kutusunu temizlemeden önce 1-2 h. Kaldır kalan yemek yemek izin.</li>
		<li>Beslenen değilse temiz worms (besleme hemen sonra bir kez ve bir kez iki gün sonra) beslenen Eğer haftada iki kez veya haftada bir kez. Temizlemek için bir plastik kabı dikkatle planarians kutusunda koruyarak suyu dökerek su tahliye. Kutusunu yüzey kağıt havlu ile silin, sonra kutunun temiz olana her tarafta tekrarlayın.</li>
		<li>Su (yaklaşık ¾ kutusu birimi için) eski yerine koymak ve gentamisin 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Hayvanlar karanlık bir dolap ya da 20 ° C kuluçka saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solucanlar yelpazesi
	<ol>
<li>5-7 gün önceden beslenen edildi solucanlar seçin. Not: Bu pharynges son zamanlarda (1-2 gün kala amputasyon) beslenen solucanlar dan kesmek önemli ölçüde daha zordur. Beslenen hayvanlar da sodyum azid için daha duyarlıdır.</li>
		<li>Aşağı yukarı 6 mm uzunluğunda olan solucanlar seçin. Solucan boyutunu tahmin etmek için bir plastik transfer pipet kullanarak bir Petri kabına aktarın. Düz 6 - inç cetvel veya 5 x 5 mm grafik kağıdı altında Petri kabına yerleştirin ve o tarar iken solucan uzunluğu ölçmek. Not: Solucanlar uzunluğu 6 mm daha küçük kesmek daha zordur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sodyum azid hazırlanması
	<ol>
<li>Sodyum azid toz planarialar suda çözülerek 100 mM çözüm hazırlamak. Uyarı: Sodyum azid toksik ve dikkatle ele alınmalıdır. Sodyum azid boşa atmayın. Aşağıdaki kullanmak, bunları ayrı ayrı olarak tehlikeli atık bertarafı için toplar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yutak amputasyon
<ol><li>Yer bir 35-mm çap Petri kabına solucanlar. Dikkatle tüm planarian su yemek plastik transfer damlalıklı kullanarak kaldırın. Not: En fazla 20 6 mm solucanlar konforlu bu büyüklükte bir tabak içinde yerleştirilebilir.</li>
	<li>Mikroskop altında tabak yerleştirin ve birden fazla kurt-ebilmek var olmak görüş aynı anda büyütme ayarlayın (örneğin 10 X büyütme). Planarian su 100 mM sodyum azid çözüm ile değiştirin. Not: Bir 35-mm Petri için yaklaşık 5 mL sodyum azid de yeterlidir. Çözüm tamamen planarians daldırın. Çözüm cilt daha büyük yemekler için gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Mikroskop ve yemek için ilk 3-4 dk taşıma kaçının altında hayvanlar izlemek.</li>
	<li>Yutak ekstrüzyon ile mikroskop gözlemlemek; yutak faringeal kese çıkıntı ve tam olarak uzatmak (yaklaşık 1 mm uzunluğunda) şekil 1Badımında gösterildiği gibi. Not: Yutak tamamen devam etmeden önce uzanan işlemini tamamlayana kadar bekleyin önemlidir. Bir kez yutak hayvandan ortaya çıkıyor, tam çekiş kabaca 1 dk alır.</li>
	<li>Bir plastik transfer damlalıklı hayvanlar çanak çevresinde bücür için kullanın. Hayvanlar damlalıklı emmek ve birkaç kez amacına zorla bırakın. Yutak tamamen uzun, bu güçlü pipetting ayırmak için neden olur.</li>
	<li>Alternatif olarak, yutak, uzunluğu boyunca dikey veya yatay olarak iyi forseps ( Tablo malzemelerigörmek) bir çift kullanarak onun çevresi boyunca şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi kavramak. Forseps sıkışmak yutak ile hayvan Menisküs yukarı doğru kaldırın. Hayvan ortaya çıkar, yüzey gerilimi hayvandan ayırmak yutak sebep olacaktır. Not: Bu yöntem, nerede güçlü dönen yeterli değil daha küçük hayvanlar (1-3 mm uzunluğunda) pharynges kaldırmak için kullanılabilir. Alay ya da başka türlü hayvan bedeni yaralanmasına kaçının.</li>
	<li>Bir aktarım damlalıklı kullanarak, uzvunu hayvanlar taze planarialar su içeren yeni bir tabak için taşıyın.</li>
	<li>Bir kez transfer, durulama iyice planarialar su tamamen üç kere su alışverişi, hayvanlarda kesilmiş. Planarialar su 50µg/mL gentamisin ile içeren yeni bir tabak aktarın. Not: Tam arabellek değişimi bu üç yıkama sırasında sodyum azid kaldırılmasını sağlamak için önemlidir.</li>
	<li>Ertesi gün, çanak suda gentamisin 50 µg/mL içeren taze planarialar su ile değiştirin. Bundan sonra her gün tekrarlayın.</li>
</ol>3. yutak kaldırıldıktan sonra amputasyon değerlendirilmesi
<ol><li>Şekil 2Agösterildiği gibi karanlık bir nokta yutak, başarılı kaldırıldıktan sonra ortaya çıkmıştır olup olmadığını belirlemek için hayvanlar (10-20 X büyütme ile) mikroskop altında incelemek.</li>
	<li>Alternatif olarak, tamir ve hayvanlar Pearson ve ark. tarafından açıklanan protokolüne göre çamaşır suyu 20. emmek hayvan gecede 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) veya fluorescently Birleşik streptavidin (1 mg/mL sulandırılmış 1:500 1 X %0,3 içeren fosfat Buffered Saline Triton-X). Hayvanlar % 80 glycerol/20% 1 X fosfat Buffered serum ve floresan stereomicroscope (şekil 2B) altında görüntü içindeki slaytları bağlama. Not: Tüm görüntüleri bu el yazması bir floresan stereomicroscope 1.0 X amacı ile ele geçirildi.</li>
</ol>4. yutak rejenerasyon davranış besleme ölçme tarafından değerlendirilmesi
<ol><li>
Karaciğer hazırlanması
	<ol>
<li>Karaciğer hamur gerekli miktar bir microcentrifuge veya konik tüp aktarın. Kısaca hava kabarcıkları kaldırmak için spin. Karaciğer hacmi tahmin ve sonra 1/5 hacminin ve kırmızı gıda boyası toplam hacminin % 2 planarialar su ekleyin. Örneğin, 1000 µL karaciğer yapıştırın, 200 µL planarialar su ve gıda renklendirme 24 µL ekleyin.</li>
		<li>Gıda renklendirme eşit olarak karaciğer Yapıştır dağıtılır kadar iyice karıştırın bir plastik havaneli, pipet ucu veya metal spatula kullanarak. Tekrar kısaca spin. Karaciğer Yapıştır 24 h için 4 ° C'de depolanan veya uzun süreli depolama için-80 ° C'de aliquots donup kalan ev.</li>
		<li>En çok 25 hayvanlar sınama olumlu sonuçlanırsa, 25 µL çanak (yaklaşık 1 µL hayvan başına karaciğer hamur) başı karaciğer hamur hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hayvan besleme
	<ol>
<li>Yedi gün sonra kimyasal amputasyon, hayvanlar için yeni Petri kabına aktarın. 10-15 hayvan sınama olumlu sonuçlanırsa, bir 35 mm tabak kullanın; 15'den fazla hayvan-meli var olmak sınav 60 mm kabında. Hayvanlar, besleme önce yaklaşık 1 h için bozulmamış anlatmamanı.</li>
		<li>Makas kullanarak, kabaca ½ cm uzakta-in dar ucuna çıkararak P200 pipet ucu genişliğini artırın. Damlalıklı 25 µL çanak içine kırmızı karaciğer yapıştırın. Not: Son kırpma viskoz karaciğer Yapıştır daha kolay pipetting sağlar. Karaciğer yüzeyinde yüzen önlemek için dağıtımı sırasında ucuna çanak dibine kadar dokunma.</li>
		<li>Hayvanlar için 30 dk beslemek izin.</li>
		<li>Hayvanlar beyaz bir arka plan üzerine yerleştirerek veya onları 10-20 X büyütme ile mikroskop altında incelenmesi tarafından yemiş hayvan sayısı puanı.</li>
		<li>Besleme sonra karaciğer yemek çıkarın ve temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+and+Cellular+Choreography+of+Appendage+Regeneration.">The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration.</a> Cell. 165, 1598-1608 (2016).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).</li><li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish.">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62, 232-240 (2013).</li><li>Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+growth+in+Drosophila+imaginal+discs+is+regulated+by+Wingless+and+Myc.">Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc.</a> Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).</li><li>Smith-Bolton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Imaginal+Discs+as+a+Model+of+Epithelial+Wound+Repair+and+Regeneration.">Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration.</a> Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).</li><li>Newmark, P. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+your+father's+planarian:+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics.">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).</li><li>Reddien, P. W., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration.">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li><li>Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoblast+specialization+in+regeneration+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).</li><li>van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+reveals+functionally+distinct+classes+within+the+planarian+stem+cell+compartment.">Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment.</a> Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).</li><li>Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+amputation+of+the+pharynx+identifies+a+FoxA-dependent+regeneration+program+in+planaria.">Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria.</a> Elife. 3, e02238 (2014).</li><li>Adler, C. E., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHRED-1+is+a+divergent+neurexin-1+homolog+that+organizes+muscle+fibers+and+patterns+organs+during+regeneration.">PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration.</a> Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).</li><li>Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+using+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system.">Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system.</a> Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C+elegans+chemotaxis+assay.">C elegans chemotaxis assay.</a> J. Vis. Exp. , e50069 (2013).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).</li><li>Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Stem+Cell+Motility+In+Vivo+Based+on+Immunodetection+of+Planarian+Neoblasts+and+Tracing+of+BrdU-Labeled+Cells+After+Partial+Irradiation.">Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation.</a> Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).</li><li>Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+screen+in+planarians+reveals+regulators+of+whole-brain+regeneration.">A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Arnold, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+shifts+in+endogenous+microbiota+impede+tissue+regeneration+via+distinct+activation+of+TAK1/MKK/p38.">Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians.">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li><li>LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+Absence+Does+Not+Regulate+Planarian+Stem+Cells+during+Eye+Regeneration.">Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration.</a> Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dopaminergic+neurons+after+6-hydroxydopamine-induced+lesion+in+planarian+brain.">Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain.</a> J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).</li><li>Wilson, D. F., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azide+inhibition+of+mitochondrial+electron+transport.+I.+The+aerobic+steady+state+of+succinate+oxidation.">Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).</li><li>Duncan, H. M., Mackler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Transport+Systems+of+Yeast:+III.+Preparation+and+properties+of+cytochrome+oxidase.">Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).</li><li>Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-specific+composition,+assembly+and+kinetics+of+stress+granules+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+nervous+system+in+the+model+planarian+Schmidtea+mediterranea:+An+immunocytochemical+study.">Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study.</a> Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).</li><li>Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Neuropeptide-Coding+Genes+Involved+in+Planarian+Pharynx+Extension.">Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension.</a> Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).</li><li>Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphic+regeneration+of+the+distal+part+of+the+planarian+pharynx.">Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx.</a> Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).</li><li>Bueno, D., Espinosa, L., Bagu&#241;&#224;, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+pharynx+regeneration+in++tail+fragments+monitored+with+cell-specific+monoclonal+antibodies.">Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies.</a> Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).</li><li>Hyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı sodyum azid kullanarak yutak seçici ablasyon yöntemi açıklar. Planarians diğer hedeflenen ablasyon çalışmaları değiştirilmiş ameliyat photoreceptors21 veya farmakolojik tedavi dopaminerjik nöron22ablate kaldırmak için kullandık. Bir önemli mevcut yöntemler üzerinde kimyasal amputasyon cerrahisi gerektirmez avantajdır. Planarian vücut diğerleri ile karşılaştırıldığında farklıdır yutak katı yapısını çok daha yumuşak g...

Rejenerasyon hayvanlar alemi tam vücut yenilenme içinde bazı omurgasızlar omurgalıların1daha sınırlı yetenekleri için arasında değişen rejeneratif kapasiteleri ile ortaya çıkan bir olgudur. Yedek fonksiyonel dokuların karmaşık bir süreçtir ve genellikle birden çok hücre tiplerinin eşzamanlı restorasyon üzerine kuruludur. Örneğin, semender uzuv, dokusunu, kondrosit, nöronlar, kas ve epitel hücreleri gerek yeniden oluşturmak için2yerini aldı. Bu yeni oluşturulan hücre tipleri de düzgün yeni bacak işlevini kolaylaştırmak için organize olmak gerekir. Bu karmaşık süreçleri anlamak belirli hücre tipleri ve organları kendi entegrasyon rejenerasyon odaklanmak teknikler gerektirir.
Rejeneratif yanıt-e doğru çalışma kolaylaştırmak için istihdam stratejileri ya belirli hücre tiplerinin hedeflenen ablasyon veya dokuların daha büyük Koleksiyonlar biridir. Örneğin, Zebra balığı, Metronidazol3,4uygulamadan sonra imha edilmesini ifade belirli hücre tipleri içinde nitroreductase yol açar. Drosophila larva pro-apoptotik genler doku özel Organizatör altında ifade seçerek özel bölgeler Imaginal disk5,6ablate. Bu stratejileri her ikisi de hızlı ama kontrollü zarar ve moleküler ve hücresel yenilenme için sorumlu mekanizmaları incelemek için kullanılır.
Bu makale, seçmeli olarak tüm organ yutak planarian Schmidtea mediterraneaadlı ablate için bir yöntemi açıklanmaktadır. Planarians nerede bile dakika parçaları bütün hayvanlar 7,8regrow rejenerasyon, üretken rejeneratif yeteneklerini bilinen klasik bir model vardır. Kök hücreler pluripotent hücreler ve soy tarafından kısıtlanmış ataları9,10,11oluşan büyük, türdeş olmayan nüfusu var. Bu hücreler çoğalırlar ve yutak, gergin, sindirim ve boşaltım sistemleri ve kas ve epitel hücreleri9,10,12de dahil olmak üzere tüm eksik dokular yerine ayırt etmek. Bu kök hücre yenilenme başlatmak biliyoruz iken, biz tam olarak onları tüm bu farklı hücre türleri yerine götürmek moleküler mekanizmaları kavramak değil. Kesin kök hücre yanıt-e doğru çıkarmak tanımlanan yaralama yöntemleri bu karmaşık süreci belirginleştiren yardımcı olabilir.
Yutak beslenmesi için gerekli bir büyük, silindirik tüp ve nöronlar, kas, epitelyal ve salgı hücreleri13,29içerir. Normalde hayvan ventral tarafta bir kese içinde gizli, hayvanın tek vücut yiyecek varlığı algılama üzerine açılış ile uzanır. Seçmeli olarak yutak kesmek için bir kimyasal denilen sodyum azid, yaygın olarak kullanılan bir anestezi C. elegans14,15,16planarians emmek. Planarians kullanımı ilk Adler ve arktarafından bildirildi., 201412. Sodyum azid maruz dakikada planarians onların pharynges bükün ve nazik ajitasyon ile yutak hayvandan ayırır. Biz bu yutak tam ve seçici kaybına yol "kimyasal amputasyon" bakın. Bir hafta sonra amputasyon, tamamen işlevsel bir yutak geri yüklenen12olur. Yutak beslenmesi için gerekli olduğundan, fonksiyonel rejenerasyon beslenme davranışı izleyerek ölçülebilir. Aşağıda, protokolü için kimyasal amputasyon ve yutak yenileme ve restorasyon davranış beslenme değerlendirmek açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1042">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td>
			<td style="width:204px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:155px;">C79-3</td>
			<td style="width:236px;">Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M65-3</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2)</td>
			<td>Acros/VWR</td>
			<td>41341-5000</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Acros Organics/VWR</td>
			<td>196770010</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Acros Organics/VWR</td>
			<td>207790050</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Acros Organics/VWR</td>
			<td>123360010</td>
			<td>Montju&#239;c salt solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific/VWR</td>
			<td>2324-0015</td>
			<td>Storing planaria water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Planaria water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Planaria water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71970</td>
			<td>Mincing liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable pastry bags-16&#8221;, 12 pack</td>
			<td>Wilton</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Liver aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL syringes</td>
			<td>BD/VWR</td>
			<td>309647</td>
			<td>Liver aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes-35mm/60mm</td>
			<td>Greiner Bio-One/VWR</td>
			<td>82050-536/82050-544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic containers (various sizes)</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Housing planarians in static culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>138030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps - Dumont Tweezer, Style 5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>72700-D (0203-5-PO)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical amputation and regeneration of the pharynx in the planarian schmidtea mediterranea

Planarians yeniden oluşturma işlemi son derece verimli solucanlar vardır. Bu yeteneği hızla herhangi bir yaralanma türüne yanıt verebilir kök hücreler çok sayıda borçlular. Bu hayvanların ortak yaralanma modellerinde birden çok organları zarar doku büyük miktarda kaldırın. Bu geniş doku hasarı üstesinden gelmek için burada seçerek tek bir organ, yutak, planarian Schmidtea mediterraneakaldırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu sitokrom oksidaz inhibitörü sodyum azid içeren bir çözümde iliklerine hayvanlar tarafından elde etmek. Sodyum azid kısa maruz kalma "kimyasal amputasyon." dediğimiz hayvan yutak ekstrüzyon neden olur Kimyasal amputasyon tüm yutak kaldırır ve nerede yutak bağırsak için verdiği küçük bir yara oluşturur. Geniş durulama sonra tüm uzvunu hayvanların yaklaşık bir hafta içinde tamamen işlevsel bir yutak yeniden. Vücudun geri kalanıyla kök hücre yenilenme yeni yutak sürücü. Burada, bir ayrıntılı sağlamak protokol için kimyasal amputasyon ve başarılı amputasyon ve rejenerasyon değerlendirmek için histolojik ve davranış yöntemleri açıklanmaktadır.

Sodyum azid maruz planarians, esneme ve kıvranmak hayvanlar neden normal hareketliliğini bozar. Bu hareketler yutak hayvan ventral taraftan çıkmaya zorlamak ve sodyum azid çözümünde yaklaşık 6 dakika sonra-ebilmek var olmak seen yutak beyaz ucu (şekil 1B-sol kapı aynası). Birkaç dakika sonra hayvanlar aktif olarak sözleşme ve tamamen yutak zorla vücut dışına iterek genişletir. (Şekil 1B</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea at JoVE.com

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Planarian Schmidtea mediterranea kök hücre ve doku rejenerasyonu çalışmak için mükemmel bir modeldir. Bu yayın seçerek bir organ, yutak, kimyasal sodyum azid hayvanlara açarak kaldırın yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca yutak rejenerasyon izlemek için yöntem açıklar.

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

chemical-amputation-regeneration-pharynx-planarian-schmidtea

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Görüntüleme.  Cornell University. Planarian Schmidtea mediterranea kök hücre ve doku rejenerasyonu çalışmak için mükemmel bir modeldir. Bu yayın seçerek bir organ, yutak, kimyasal sodyum azid hayvanlara açarak kaldırın yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca yutak rejenerasyon izlemek için yöntem açıklar.

Video: Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Gelişim Biyolojisi

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. This morphological alteration is also recognized as epithelial to mesenchymal transition (EMT). Dysregulation of EMT is associated with fibrosis and cancer metastasis. There is emerging evidence that EMT is controlled by a number of molecular mechanisms. As such, many key genes that control apical constriction are also known to be important factors in the EMT observed in cancer metastasis. Like EMT during Drosophila gastrulation, epithelial cells can be induced to change their shape and be reprogrammed to redirect cell fate towards various other cell types. Here we provide a robust imaging method of Drosophila gastrulation to assay the initiation of morphogenetic cellular movements and cell fate identification during this stage of embryonic development. Using this method, we identify cell rearrangement at the time of gastrulation and demonstrate the importance of apical constriction during gastrulation using GFP labeled DE-cadherin.

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

Hücre Şekli Alteration ve Hücre Hareketi Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Gastrulasyon kullanarak DE-kaderin Muhabir Transgenik Sinekler

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Yetişkin fare basamak amputasyon ve rejenerasyonu: Mammalin Blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için basit bir model

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

Sıçan Yağ Dokusu Mezenkimal Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Hücrelere Farklılaşması İçin İzolasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...