هذه المنهجية الجديدة تسمح لنا ببناء جمعيات ثلاثية الأبعاد ، مقتبسة من الخلايا الفردية المطلوبة ، في محلول عازل مائي يحتوي على بوليمر هيدروفيلي غير محدد ، من خلال إنشاء اتصال الخلية الخلية المستقرة. في هذا الفيديو، سوف نُظهر كيف نتلاعب بالخلايا المفردة المطلوبة ونبني جمعيات خلوية ثلاثية الأبعاد بدون سقالة اصطناعية. هنا سوف نظهر الإجراء التجريبي في وسطنا مع ديكستران كمثال.
للبدء، والحفاظ على نامرو الماوس الخلايا الظهارية الغدة مع خمسة ملليلتر من DMEM، التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين، في قارورة 25 سم مكعب لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. عندما تكون على استعداد للمضي قدما، واستخدام الطامح لإزالة DMEM المكملة وإضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني، التي هي محمّاة إلى 37 درجة مئوية لغسل الخلايا. باستخدام الزّب، أزل كلّ الـ بي بي إس من القارورة.
إضافة 1.5 ملليلتر من التربسين التي يتم تسخينها مسبقا في 37 درجة مئوية. احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة أو دقيقتين على الأقل. بعد هذا, إضافة 3.5 ملليلتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين.
الماصة صعودا وهبوطا لخلط. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر والطرد المركزي في 417 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، pirate المتوسطة.
إضافة خمسة ملليمترات من DMEM الطازجة التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين. وإذا لزم الأمر، استخدم حل الحفظ بالتبريد للتبريد الخلايا كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. أول مزيج 10 ملليلتر من DMEM تكملها 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين مع 0.8 غرام من ديكستران, لإعداد 80 مليغرام لكل ميل المليت ديكستران.
مزيج 200 ميكرولترات من هذا الحل Dextran مع 200 microliters من تعليق الخلية المعدة سابقا، لإنشاء تعليق الخلية التي تحتوي على 40 ملليغرام لكل ملليلتر Dextran المتوسطة. للبدء، قم بتشغيل الليزر، لاحظ أن استخدام شعاع الليزر مع طول موجي في المنطقة الحمراء إلى القريبة من الأشعة تحت الحمراء هو الأكثر فعالية. المقبل فتح البرنامج عن طريق النقر المزدوج على رمز البرنامج.
انقر نقرًا مزدوجًا فوق رمز الكاميرا ولاحظ أن الشاشة المقابلة ستظهر. ثم انقر نقرا مزدوجا على الرموز للصمام الثنائي الباعث للضوء، وضبط التركيز، ومرحلة متحركة لفتح يعرض بهم كذلك. المركز الأول اثنين من الفواصل الزجاجية على الشريحة الزجاجية الغطاء السفلي.
نقل 20 microliters، وDextran أعدت سابقا استكمال تعليق الخلية على الشريحة الزجاجي الغطاء السفلي. ثم ضع الشريحة الزجاجية غطاء أعلى على الفواصل التي تغطي تعليق الخلية. ضع خلية العينة على العدسة ذات الهدف الأدنى مع 10 ميكرولترات من الماء المقطر للمجهر الغمر بالماء.
نعلق عدسة الهدف العلوي في الجزء العلوي من الخلية عينة باستخدام 10 ميكرولترات من الماء المقطر. بعد ذلك، انقر فوق زر التشغيل في نافذة الإضاءة المجهر لتشغيل LED. انقر على أزرار الاتجاه في إطار تحديد المواقع الهدف لضبط المسافة بين العينة والعدسة الهدف أقل حتى يكون في التركيز.
تعيين شدة كل شعاع ليزر إلى 1500 مللي واط في نافذة التوهين إشارة. ثم، انقر فوق اثنين من رموز الليزر لتشعيع أشعة الليزر في موقف واحد والموضع الثاني. انقر على أزرار الاتجاه في إطار تحديد المواقع عينة لنقل مرحلة العينة حتى يتم احتجاز خلية في الموضع الأول.
انقر واسحب المؤشر الذي يشير إلى الموضع الثاني حتى يتم احتجاز خلية أخرى في الموضع الثاني. للبدء، معالجة خلية واحدة، بحيث يكون على اتصال مع خلية أخرى. حافظ على هذا الشرط لمدة 300 ثانية، بحيث تتعرض الخلية بالليزر لمدة 300 ثانية.
سجل محور س ص. اعتراض خلية أخرى ونقلها إلى أول خليتين لإنشاء تجميع خلية 2D إجبارية. ثم نقل المرحلة صعودا وهبوطا لبناء الجمعية الخلوية 3D.
تأكد من أن التجميع لا يزال مستقراً حتى بعد إيقاف تشغيل الليزر. في هذه الدراسة تستخدم البوليمرات القابلة للذوبان في بناء 3D تجميعات خلية واحدة. مثال هيكل شكلت باستخدام ملاقط بصرية مزدوجة الحزم هو مبين هنا.
إذا كانت التجربة ناجحة، تبقى هذه التجميعات الخلوية مستقرة حتى بعد إيقاف تشغيل الليزر. هذه المنهجية الجديدة هي لبناء الجمعيات الخلوية 3D في وسط مائي مع البوليمر المائي الطبيعي. ومن المتوقع جدا لبدء بناء هذا النوع من الجيل القادم من الجمعيات الخلوية مع بعض الأدوات القوية في مجال الطب التجديدي وهندسة الأنسجة.
