Esta nova metodologia nos permite construir conjuntos tridimensionais, adaptados de células individuais desejadas, em uma solução tampão aquosa contendo polímero hidrofílico não específico, estabelecendo contato estável célula-célula. Neste vídeo, vamos demonstrar como manipulamos células únicas desejadas e construímos conjuntos celulares 3D sem andaime artificial. Aqui vamos mostrar o procedimento experimental em nosso meio com o Dextran como exemplo.
Para começar, mantenha as células epiteliais da glândula mamária do rato NAMRU com cinco mililitros de DMEM, contendo 10% de FBS e 1%Penicilina-Estreptomicina, em um frasco de 25 centímetros cúbicos por dois a três dias. Quando estiver pronto para prosseguir, use um aspirador para remover o DMEM suplementado e adicione três a cinco mililitros de PBS, que é pré-aquecido a 37 graus Celsius para lavar as células. Usando um aspirador, remova todo o PBS do frasco.
Adicione 1,5 mililitros de trippsina que é pré-aquecido a 37 graus Celsius. Incubar em uma incubadora de CO2 a 37 graus Celsius por pelo menos um a dois minutos. Depois disso, adicione 3,5 mililitros de DMEM contendo 10% FBS e 1%Penicilina-Streptomicina.
Pipeta para cima e para baixo para misturar. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 417 vezes G por três minutos à temperatura ambiente. Então, aspire o meio.
Adicione cinco milímetros de DMEM fresco contendo 10% FBS e 1%Penicilina-Estreptomicina. E se necessário, use uma solução de criopreservação para criopreservar as células conforme descrito pelas instruções do fabricante. Primeiro misture 10 mililitros de DMEM suplementados com 10% FBS e 1%Penicillin-Streptomycina com 0,8 gramas de Dextran, para preparar uma solução de 80 miligramas por mililitro Dextran.
Misture 200 microliters desta solução Dextran com 200 microlitres da suspensão celular previamente preparada, para criar uma suspensão celular contendo 40 miligramas por mililitro de dextran médio. Para começar, ligue o laser, note que o uso de um raio laser com um comprimento de onda na região vermelha e quase infravermelha é mais eficaz. Em seguida, abra o software clicando duas vezes no ícone do software.
Clique duas vezes no ícone da câmera e note que o display correspondente aparecerá. Em seguida, clique duas vezes nos ícones para o diodo emissor de luz, o ajuste do foco e o estágio móvel para abrir seus displays também. Primeiro lugar dois espaçadores de vidro na tampa inferior do deslizamento de vidro.
Transfira 20 microliters, a suspensão celular previamente preparada do Dextran para o slide de vidro da tampa inferior. Em seguida, coloque o deslizamento de vidro da tampa superior sobre os espaçadores que cobrem a suspensão da célula. Coloque a célula amostral na lente objetiva inferior com 10 microliters de água destilada para microscopia de imersão hídrica.
Conecte a lente objetiva superior na parte superior da célula amostral usando 10 microliters de água destilada. Em seguida, clique no botão de desligar na janela de iluminação do microscópio para ligar o LED. Clique nos botões de direção na janela de posicionamento objetivo para ajustar a distância entre a amostra e a lente objetiva inferior até que ela esteja em foco.
Defina a intensidade de cada raio laser para 1500 miliwatts na janela de atenuação do sinal. Em seguida, clique nos dois ícones laser para irradiar os raios laser na posição um e posição dois. Clique nos botões direcionais na janela de posicionamento da amostra para mover o estágio da amostra até que uma célula esteja presa na posição um.
Clique e arraste o cursor indicando a posição dois até que outra célula esteja presa na posição dois. Para começar, manipule uma única célula, para que ela esteja em contato com outra célula. Mantenha esta condição por 300 segundos, de modo que a célula seja exposta a um laser por 300 segundos.
Registo o eixo x-y. Presenti-lo outra célula e transportá-la para as duas primeiras células para construir um conjunto arbitrário de células 2D. Em seguida, mova o palco para cima e para baixo para construir um conjunto celular 3D.
Confirme se o conjunto ainda está estável mesmo depois que o laser estiver desligado. Neste estudo, os polímeros solúveis são utilizados na construção de conjuntos de células únicas 3D. Uma estrutura de exemplo formada usando a pinça óptica de feixe duplo é mostrada aqui.
Se o experimento for bem sucedido, esses conjuntos celulares permanecem estáveis mesmo após o laser ser desligado. Esta nova metodologia é para a construção de conjuntos celulares 3D em um meio aquoso com polímero hidrofílico natural. Espera-se que comece a construção desse tipo de conjuntos celulares de próxima geração com algumas das ferramentas poderosas no campo da medicina regenerativa e da engenharia de tecidos.
