Esta novedosa metodología nos permite construir conjuntos tridimensionales, adaptados a partir de células individuales deseadas, en una solución tampón acuosa que contiene polímero hidrófilo inespecífico, estableciendo un contacto estable entre células y células. En este video, demostraremos cómo manipulamos las celdas individuales deseadas y construimos conjuntos celulares 3D sin andamios artificiales. Aquí vamos a mostrar el procedimiento experimental en nuestro medio con Dextran como ejemplo.
Para empezar, mantenga las células epiteliales de la glándula mamaria del ratón NAMRU con cinco mililitros de DMEM, que contienen 10%FBS y 1%Penicilina-Estreptomicina, en un matraz de 25 centímetros cúbicos durante dos a tres días. Cuando esté listo para proceder, utilice un aspirador para eliminar el DMEM suplementado y agregue de tres a cinco mililitros de PBS, que se precalienta a 37 grados Celsius para lavar las células. Con un aspirador, retire todo el PBS del matraz.
Añadir 1,5 mililitros de trippsina que se precalienta a 37 grados centígrados. Incubar en una incubadora de CO2 a 37 grados centígrados durante al menos uno o dos minutos. Después de esto, añadir 3.5 mililitros de DMEM que contiene 10%FBS y 1%Penicilina-Estreptomicina.
Pipetear arriba y abajo para mezclar. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 mililitros y centrifugarlo a 417 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Entonces, aspira el medio.
Añadir cinco milímetros de DMEM fresco que contiene 10%FBS y 1%Penicilina-Estreptomicina. Y si es necesario, utilice una solución de criopreservación para criopreservar las células como se describe en las instrucciones del fabricante. Primera mezcla 10 mililitros de DMEM complementados con 10%FBS y 1%Penicilina-Estreptomicina con 0.8 gramos de Dextran, para preparar una solución de Dextran de 80 miligramos por mililitro.
Mezclar 200 microlitros de esta solución Dextran con 200 microlitros de la suspensión celular previamente preparada, para crear una suspensión celular que contenga 40 miligramos por mililitro Medio Dextran. Para empezar, encienda el láser, tenga en cuenta que el uso de un rayo láser con una longitud de onda en la región roja a casi infrarrojo es más eficaz. A continuación, abra el software haciendo doble clic en el icono del software.
Haga doble clic en el icono de la cámara y tenga en cuenta que aparecerá la pantalla correspondiente. A continuación, haga doble clic en los iconos del diodo emisor de luz, el ajuste de enfoque y la etapa móvil para abrir sus pantallas también. Primero coloque dos espaciadores de vidrio en el portaobjetos de vidrio de la cubierta inferior.
Transfiera 20 microlitros, la suspensión celular suplementada de Dextran previamente preparada en el portaobjetos de vidrio de la cubierta inferior. A continuación, coloque la corredera de vidrio de la cubierta superior sobre los espaciadores que cubren la suspensión celular. Coloque la célula de muestra en la lente objetivo inferior con 10 microlitros de agua destilada para microscopía de inmersión en agua.
Coloque la lente objetivo superior en la parte superior de la celda de la muestra utilizando 10 microlitros de agua destilada. A continuación, haga clic en el botón de encendido y apagado en la ventana de iluminación del microscopio para encender el LED. Haga clic en los botones de dirección en la ventana de posicionamiento objetivo para ajustar la distancia entre la muestra y el objetivo inferior hasta que esté enfocado.
Establezca la intensidad de cada rayo láser en 1500 milivatios en la ventana de atenuación de señal. A continuación, haga clic en los dos iconos láser para irradiar los rayos láser en la posición uno y la posición dos. Haga clic en los botones direccionales de la ventana de posicionamiento de la muestra para mover la etapa de muestra hasta que una celda quede atrapada en la posición uno.
Haga clic y arrastre el cursor indicando la posición dos hasta que otra celda quede atrapada en la posición dos. Para empezar, manipule una sola celda, de modo que esté en contacto con otra celda. Mantenga esta condición durante 300 segundos, de modo que la célula se exponga a un láser durante 300 segundos.
Registre el eje x-y. Atrapa otra celda y transporta a las dos primeras celdas para construir un conjunto de celdas 2D arbitrario. A continuación, mueva el escenario hacia arriba y hacia abajo para construir un conjunto celular 3D.
Confirme que el conjunto sigue siendo estable incluso después de apagar el láser. En este estudio, los polímeros solubles se utilizan en la construcción de conjuntos de células simples 3D. Aquí se muestra una estructura de ejemplo formada con las pinzas ópticas de doble haz.
Si el experimento es exitoso, estos conjuntos celulares permanecen estables incluso después de que el láser está apagado. Esta nueva metodología es para la construcción de conjuntos celulares 3D en un medio acuoso con polímero hidrófilo natural. Se espera que comience la construcción de este tipo de conjuntos celulares de próxima generación con algunas de las poderosas herramientas en el campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos.
