Эта новая методология позволяет нам строить трехмерные сборки, адаптированные из желаемых отдельных клеток, в аквозном буферном растворе, содержащем неспецифический гидрофильные полимеры, путем установления стабильного контакта клеток и клеток. В этом видео мы продемонстрируем, как мы манипулируем желаемыми одиночными ячейками и строим 3D клеточные сборки без искусственных эшафотов. Здесь мы покажем экспериментальную процедуру в нашей среде с Dextran в качестве примера.
Для начала, поддерживать NAMRU мыши молочной железы эпителиальных клеток с пятью миллилитров DMEM, содержащий 10%FBS и 1%Пенициллин-Стрептомицин, в 25 кубических сантиметров колбы в течение двух-трех дней. Когда готовы приступить, используйте аспиратор, чтобы удалить дополненный DMEM и добавить три-пять миллилитров PBS, который разогрет до 37 градусов по Цельсию, чтобы мыть клетки. Используя аспиратор, удалите все PBS из колбы.
Добавьте 1,5 миллилитров трипсина, который разогревается при 37 градусах Цельсия. Инкубация в инкубаторе CO2 при 37 градусах по Цельсию в течение по крайней мере одной-двух минут. После этого добавьте 3,5 миллилитров DMEM, содержащих 10%FBS и 1%Пенициллин-Стрептомицин.
Pipette вверх и вниз, чтобы смешать. Перенесите подвеску клетки в 15-миллилитровую центрифугу и центрифуга в 417 раз G в течение трех минут при комнатной температуре. Затем, аспирировать среды.
Добавьте пять миллиметров свежего DMEM, содержащего 10%FBS и 1%Пенициллин-Стрептомицин. А при необходимости используйте криоконсервативное решение, чтобы криопресервирование клеток, как это предусмотрено инструкциями производителя. Первая смесь 10 миллилитров DMEM дополнена 10%FBS и 1%Пенициллин-Стрептомицин с 0,8 грамма Декстрана, чтобы подготовить 80 миллиграмм на миллилитр Dextran раствор.
Смешайте 200 микролитров этого раствора Dextran с 200 микролитров ранее подготовленной клеточной подвески, чтобы создать клеточную подвеску, содержащую 40 миллиграммов на миллилитр Dextran среды. Для начала включите лазер, обратите внимание, что использование лазерного луча с длиной волны в красном и ближнем инфракрасном регионе является наиболее эффективным. Затем откройте программное обеспечение, дважды нажав значок программного обеспечения.
Дважды нажмите значок для камеры и обратите внимание, что соответствующий дисплей будет всплывающее. Затем дважды нажмите на значки для света, излучающего диод, регулировка фокуса и движущийся этап, чтобы открыть свои дисплеи, а также. Первое место два стеклянных проемов на нижней крышке стекла слайд.
Перенесите 20 микролитров, предварительно подготовленный Dextran дополнил подвеску клетки на нижнюю крышку стеклянной горки. Затем поместите верхнюю крышку стеклянной горки на спейсеры, покрывающие подвеску ячейки. Поместите выборку ячейки на нижнюю объективную линзу с 10 микролитров дистиллированной воды для микроскопии погружения в воду.
Прикрепите верхнюю объектив в верхней части выборочных клеток с помощью 10 микролитров дистиллированной воды. Затем нажмите кнопку выключать в окне освещения микроскопа, чтобы включить светодиод. Нажмите на кнопки направления в окне объективного позиционирования, чтобы настроить расстояние между образцом и объективом нижней цели до тех пор, пока он не будет в фокусе.
Установите интенсивность каждого лазерного луча до 1500 милливатт в окне затухания сигнала. Затем нажмите на две лазерные иконки, чтобы облучить лазерные лучи в положении один и положение два. Нажмите на кнопки направления в окне позиционирования образца, чтобы переместить этап выборки до тех пор, пока ячейка не будет поймана в ловушку в первом положении.
Нажмите и перетащите курсор, указывающий на положение два, пока другая ячейка не будет поймана в ловушку на второй позиции. Для начала манипулируйте одной ячейкой, чтобы она контактировать с другой ячейкой. Поддерживайте это условие в течение 300 секунд, так что клетка подвергается воздействию лазера в течение 300 секунд.
Запись x-y-оси. Ловушка другой ячейки и транспортировать его в первые две ячейки, чтобы построить произвольные 2D сборки ячейки. Затем переместив сцену вверх и вниз, чтобы построить 3D сотовую сборку.
Подтвердите, что сборка по-прежнему стабильна даже после того, как лазер выключен. В этом исследовании растворимые полимеры используются при строительстве 3D одноклеточных сборок. Здесь показана примерная структура, сформированная с использованием двухлучевой оптической пинцеты.
Если эксперимент будет успешным, эти клеточные сборки остаются стабильными даже после того, как лазер выключен. Эта новая методология для строительства 3D клеточных сборок в aqueous среде с натуральным гидрофильным полимером. Ожидается, что строительство таких клеточных агрегатов нового поколения начнется с помощью мощных инструментов в области регенеративной медицины и тканевой инженерии.
