ومن المعروف P19 خط الخلية للتمييز في الخلايا العصبية. ومع ذلك، بروتوكول لتمايز الخلايا العصبية من خط الخلية P19 معقدة في بعض الأحيان. هذه الطريقة تسمح لنا لأداء تجربة neurogenic بطريقة سهلة الاستعمال وتوسيع إمكانية استخدام خط الخلية P19 للمستقبل.
للبدء، والحفاظ على الخلايا P19 في وسط الصيانة، وتتألف من DMEM، مع 4.5 غرام لكل لتر من الجلوكوز، تستكمل مع مصل الأبقار الجنين 10٪، 100 وحدة لكل المليلتر البنسلين، و 100 وحدة لكل ملليلتر الستريبتوميسين. احتضان ثقافة الخلية في بيئة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الخلايا هي ما يقرب من 80٪ التقاء. إزالة المتوسطة المستهلكة من قارورة ثقافة الخلية وغسل الخلايا مع ملليلتر اثنين من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من برنامج تلفزيوني.
إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين-EDTA لتغطية تماما أحادية من الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. تحت المجهر، تحقق لمعرفة ما إذا كانت جميع الخلايا منفصلة. resuspend الخلايا في تسعة ملليلتر من متوسطة الصيانة من أجل تحييد التربسين.
نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 200 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لبيده الخلايا. ثم، pirate الماكر دون إزعاج بيليه. resuspend بيليه في 10 ملليلتر من وسط الصيانة الطازجة واستخدام عداد الخلية لتحديد رقم الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
بذور 20،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في قارورة T-25 جديدة وإضافة ما يصل إلى 10 ملليلتر من متوسط الصيانة. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. لبدء عملية الهضم التربسين، أول التعرق ببطء supernatant وغسل الخلايا مع مليلتر اثنين من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من برنامج تلفزيوني.
ثم، إضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ التربسين EDTA إلى الخلايا واحتضان لهم في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد الحضانة، لتحييد التربسين، resuspend الخلايا في تسعة ملليلتر من التمايز المتوسطة، وتتألف من DMEM مع مستوى الجلوكوز عالية ومكملة مع مصل الأبقار الجنين 5٪، 100 وحدة لكل المليلتر البنسلين، و 100 وحدة لكل ملليلتر ستريبتوميسين. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي في 200 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لبيده الخلايا.
ثم, ببطء التعرق وssuspend بيليه في ملليلتر واحد من التمايز المتوسطة الطازجة دون RA. استخدم عداد خلية لتحديد رقم الخلية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. لتوليد المجموع، تبدأ بإضافة 10 ملليلتر من التمايز المتوسطة، تستكمل مع خمسة ميكرولترات من RA إلى 100 ملليلتر، طبق الثقافة غير المعالجة. بذور مليون خلية في طبق الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين من أجل تعزيز تشكيل الكلي.
بعد الحضانة ، مع ماصة 10 ملليلتر ، pirate المتوسطة التي تحتوي على المجاميع ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر في درجة حرارة الغرفة. انتظر لمدة 1.5 دقيقة للمجاميع لتستقر في الأسفل ثم تجاهل supernatant. إضافة 10 ملليلتر من التمايز الطازج المتوسطة تستكمل مع 0.5 RA ميكرومولار. بذور بلطف المجاميع في جديد 100 ملليمتر، طبق ثقافة غير المعالجة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين.
للبدء، استخدم ماصة 10 ملليلتر لنقل مجاميع الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر. انتظر لمدة 1.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للمجاميع ليستقر في الجزء السفلي ثم تجاهل supernatant. غسل المجاميع مع الدم والمضادات الحيوية خالية DMEM.
انتظر مجاميع الخلايا لتستقر في الأسفل، وتخلص من المابير، ثم أضف ميليلترين من 0.25٪ تريبسين EDTA. احتضان الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، والتنصت كل دقيقتين للحفاظ على الخلايا في التعليق. ثم، إضافة أربعة ملليلتر من متوسط الصيانة من أجل وقف نشاط التربسين والماصة صعودا وهبوطا 20 مرة باستخدام ماصة ملليلتر واحد.
وأخيرا، الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. إزالة نابير و resuspend بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من وسط الصيانة. استخدام عداد خلية لتحديد رقم الخلية والمضي قدما في طلاء الخلايا.
إلى خلايا لوحة، أولا إضافة ثلاثة ملليلتر في بئر من متوسطة الصيانة إلى لوحة ثقافة ستة بئر. ثم، بذور الخلايا في كثافة 500،000 في البئر. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بذور الخلايا على غطاء النظارات في لوحة ثقافة ستة بئر. عندما تصل إلى التقاء 20٪، انتقل إلى المناعة مع الأجسام المضادة MAP2. ثم، عزل RNA، وتنفيذ النسخ العكسي PCR لـ MAP2، NueN، OCT4، NANOG، و GAPDH.
في هذه الدراسة، يتم إدخال طريقة مبسطة للتمايز العصبي. يتم استزراع خط الخلايا P19 في طبق ثقافة غير معالج مع 5٪ FBS و 0.5 RA ميكرومولار. بعد أربعة أيام، يتم فصل مجاميع الخلية مع التربسين وبذر على لوحة ثقافة الخلية الملتزمة للأيام الأربعة المقبلة. يتم تقييم كفاءة هذا الأسلوب من خلال المقارنة بين تحليل RTPCR لخط الخلية P19 في حالة غير متمايزة وأثناء تولد الخلايا العصبية.
تظهر النتائج انخفاضًا سريعًا في التعبير عن جينات القدرة المتعددة، مثل Oct4 و NANOG، وتراكم جينات العلامات النوراومية، مثل MAP2 وNN. ونحن نعتقد أن الطريقة التي وضعت في هذه الدراسة بسيطة وسوف تلعب دورا في توضيح الآليات الجزيئية لنشوء الخلايا العصبية، فضلا عن الأمراض العصبية.
