P19 세포주 신경으로 분화 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, P19 세포주 뉴런 분화를 위한 프로토콜은 때때로 복잡합니다. 이 방법을 통해 우리는 사용자 친화적 인 방식으로 신경 유발 실험을 수행하고 미래를위한 P19 세포주 사용 가능성을 확대 할 수 있습니다.
시작하려면, DMEM로 구성된 유지 보수 매체에서 P19 세포를 유지, 와 4.5 포도당의 리터 당 그램, 보충 10% 태아 소 혈청, 100 밀리 리터 페니실린 당 단위, 그리고 100 밀리리터 연쇄 상 감식 당 단위. 세포 배양을 섭씨 37도 및 5%의 이산화탄소 환경에서 세포가 약 80%의 컨실업할 때까지 배양합니다. 세포 배양에서 소비된 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 2밀리리터로 세포를 세척합니다.
세포의 단층을 완전히 커버하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 2~3분 동안 배양하기 위해 0.25%의 트립신-EDTA 1밀리리터를 추가합니다. 현미경의 밑에, 모든 세포가 분리되어 있는지 확인하십시오. 트립신을 중화시키기 위해 유지 보수 매체의 9 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
세포를 15밀리리터 튜브와 원심분리기로 200배 G및 실온으로 5분간 전달하여 세포를 펠릿합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 상류체를 흡인시합니다. 신선한 유지 보수 매체의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 제조업체의 지침에 따라 세포 수를 결정하기 위해 셀 카운터를 사용합니다.
씨앗 20, 새로운 T-25 플라스크에 평방 센티미터 당 000 세포및 유지 보수 매체의 최대 10 밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2~3일 동안 배양합니다. 트립신 소화를 시작하려면 먼저 체퍼를 천천히 흡인시키고 칼슘과 마그네슘이없는 PBS의 두 밀리리터로 세포를 씻으십시오.
그런 다음, 세포에 0.25%의 트립신 EDTA의 1 밀리리터를 추가하고 2 ~ 3 분 동안 섭씨 37도 및 5 %의 이산화탄소로 배양합니다. 인큐베이션 후, 트립신을 중화시키고, 포도당 수준이 높은 DMEM로 구성되고 5%의 태아 소 혈청, 밀리리터 페니실린 당 100단위, 밀리리터 연쇄절제술당 100단위로 보충된 분화 매체의 9밀리리터에서 세포를 재연한다. 세포를 15밀리리터 튜브와 원심분리기로 200배 G및 실온으로 5분간 전달하여 세포를 펠릿합니다.
그런 다음, 서서히 상류체를 흡인하고 RA없이 신선한 분화 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 재중단합니다. 셀 카운터를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 셀 번호를 결정합니다. 집계 생성의 경우, 100 밀리리터, 비처리 배양 접시에 5개의 마이크로리터로 보완된 분화 매체10밀리리터를 첨가하여 시작합니다. 배양 접시에 100만 개의 세포를 심고 2일 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양하여 골형성을 촉진합니다.
인큐베이션 후, 10밀리리터 파이펫을 사용하여, 골재를 포함하는 매체를 흡인하고 실온에서 15 밀리리터 튜브로 옮김시한다. 골재가 바닥에 정착할 때까지 1.5분 동안 기다린 다음 상체를 폐기하십시오. 0.5 마이크로몰라 RA로 보충된 신선한 분화 매체 10밀리리터를 추가합니다. 새로운 100mm, 비처리 배양 접시에 골재를 부드럽게 시드하고 2일 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
시작하려면 10밀리리터 파이펫을 사용하여 셀 응집체를 15밀리리터 튜브로 전송합니다. 골재가 바닥에 정착한 다음 상체를 폐기할 때까지 실온에서 1.5분 동안 기다립니다. 혈청과 항생제가 없는 DMEM으로 골재를 씻으시다.
셀 골재가 바닥에 정착하고, 상체를 폐기하고, 0.25%의 트립신 EDTA의 2밀리리터를 추가할 때까지 기다립니다. 10 분 동안 37섭씨 37도의 수조에서 튜브를 배양하여 2분마다 눌러 세포를 서스펜션 상태로 유지합니다. 그런 다음 트립신 활성을 중지하기 위해 유지 보수 매체의 4 밀리리터를 추가하고 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 20 회 위아래로 피펫을 피펫합니다.
마지막으로, 세포를 200배 G로, 실온을 5분 동안 원심분리합니다. 상체를 제거하고 유지 보수 매체의 5 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 분리합니다. 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 결정하고 세포도금으로 진행합니다.
플레이트 셀에 먼저 유지 보수 매체의 웰당 3 밀리리터를 6웰 배양 판에 넣습니다. 그런 다음, 세포를 500, 000의 밀도로 잘 시드한다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
6웰 배양판에 커버 안경에 세포를 시드. 20%의 합류에 도달하면, 항 MAP2 항체로 면역염색을 진행한다. 이어서, RNA를 분리하고, MAP2, 누엔, OCT4, NANOG 및 GAPDH에 대한 역전사 PCR을 수행한다.
이 연구에서는, 신경 분화를 위한 단순화된 방법이 소개됩니다. P19 세포주5%FBS 와 0.5 마이크로몰라 RA를 가진 비처리 배양 접시에서 배양된다. 4 일 후, 세포 응집체는 트립신과 해리되고 다음 4 일 동안 부착 된 세포 배양 판에 시드됩니다. 이 방법의 효율은 미분화 상태 및 신경 발생 시 P19 세포주의 RTPCR 분석 사이의 비교에 의해 평가된다.
결과는 10월4및 NANOG와 같은 흉병 유전자의 발현의 급속한 감소및 MAP2 와 NeuN과 같은 neurnomal 마커 유전자의 강화 조절을 보여줍니다. 우리는 이 연구 결과에서 개발된 방법이 간단하고 신경 발생의 분자 기계장치를 해명하는 역할을 할 것이라는 점을 믿습니다, 신경 퇴행성 질병.
