La línea celular P19 se sabe que se diferencia en neuronas. Sin embargo, el protocolo para la diferenciación de neuronas de la línea celular P19 a veces es complicado. Este método nos permite realizar el experimento neurogénico de una manera fácil de usar y ampliar la posibilidad del uso de la línea celular P19 para el futuro.
Para empezar, mantener las células P19 en medio de mantenimiento, compuestas de DMEM, con 4,5 gramos por litro de glucosa, complementadas con 10% de suero bovino fetal, 100 unidades por cuacilitalitro y 100 unidades por etillita mililitro. Incubar el cultivo celular en un ambiente de 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono hasta que las células sean aproximadamente 80%confluentes. Retire el medio gastado del matraz de cultivo celular y lave las células con dos mililitros de CALCIO y PBS libre de magnesio.
Añadir un mililitro de 0.25%trypsin-EDTA para cubrir completamente la monocapa de las células e incubar a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante dos a tres minutos. Bajo un microscopio, compruebe si todas las células están desprendidas. Resuspender las células en nueve mililitros de medio de mantenimiento con el fin de neutralizar la tripina.
Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos para peletizar las células. A continuación, aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet. Resuspender el pellet en 10 mililitros de medio de mantenimiento fresco y utilizar un contador de células para determinar el número de celda de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Semilla 20.000 células por centímetro cuadrado en un nuevo matraz T-25 y suman hasta 10 mililitros de medio de mantenimiento. Incubar a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante dos o tres días. Para comenzar la digestión de la trippsina, primero aspira lentamente el sobrenadante y lava las células con dos mililitros de calcio y PBS libre de magnesio.
Luego, agrega un mililitro de 0.25%trypsin EDTA a las células e incubarlas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante dos a tres minutos. Después de la incubación, para neutralizar la tripina, resuspender las células en nueve mililitros de medio de diferenciación, compuesto de DMEM con alto nivel de glucosa y complementado con 5% de suero bovino fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina, y 100 unidades por estreptomicina mililitro. Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos para peletizar las células.
Luego, aspira lentamente el sobrenadante y resuspenda el pellet en un mililitro de medio de diferenciación fresco sin RA. Utilice un contador de celdas para determinar el número de celda de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la generación agregada, comience agregando 10 mililitros de medio de diferenciación, complementados con cinco microlitros de RA a un plato de cultivo no tratado de 100 mililitros. Siembra un millón de células en el plato de cultivo e incuba a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono durante dos días con el fin de promover la formación de agregados.
Después de la incubación, con una pipeta de 10 mililitros, aspirar el medio que contiene los agregados y transferirlo a un tubo de 15 mililitros a temperatura ambiente. Espere 1,5 minutos para que los agregados se asienten en la parte inferior y, a continuación, deseche el sobrenadante. Añadir 10 mililitros de medio de diferenciación fresco complementado con 0,5 micromolarES RA. Siembra suavemente los agregados en un nuevo plato de cultivo no tratado de 100 milímetros e incuba a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos días.
Para comenzar, utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir los agregados celulares a un tubo de 15 mililitros. Espere 1,5 minutos a temperatura ambiente para que los agregados se asienten en la parte inferior y luego deseche el sobrenadante. Lave los agregados con suero y DMEM libre de antibióticos.
Espere a que los agregados de celda se asienten en la parte inferior, deseche el sobrenadante y agregue dos mililitros de 0.25%trypsin EDTA. Incubar el tubo en un baño de agua a 37 grados celsius durante 10 minutos, tocando cada dos minutos para mantener las células en suspensión. A continuación, añada cuatro mililitros de medio de mantenimiento para detener la actividad de la trippsina y la pipeta hacia arriba y hacia abajo 20 veces utilizando una pipeta de un mililitro.
Finalmente, centrifugar las células a 200 veces G y temperatura ambiente durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet celular en cinco mililitros de medio de mantenimiento. Utilice un contador de celdas para determinar el número de celda y proceder con el recubrimiento de las celdas.
A las celdas de la placa, primero agregue tres mililitros por pozo de medio de mantenimiento a una placa de cultivo de seis pozos. Luego, siembra las células a una densidad de 500.000 por pozo. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
Siembra las células de los vasos de cubierta en una placa de cultivo de seis pozos. Cuando alcancen el 20% de confluencia, proceda a la inmunomancha con anticuerpos Anti-MAP2. A continuación, aísle el ARN y realice la transcripción inversa PCR para MAP2, NueN, OCT4, NANOG y un GAPDH.
En este estudio, se introduce un método simplificado para la diferenciación neuronal. La línea celular P19 se cultiva en un plato de cultivo no tratado con 5% FBS y 0.5 RA micromolar. Después de cuatro días, los agregados celulares se disoccian con tripina y se siembran en una placa de cultivo celular adherente durante los próximos cuatro días. La eficiencia de este método se evalúa mediante la comparación entre el análisis RTPCR de la línea celular P19 en un estado indiferenciado y durante la neurogénesis.
Los resultados muestran una rápida disminución de la expresión de genes de pluripotencia, como Oct4 y NANOG, y una regulación ascendente de genes marcadores neurnomales, como MAP2 y NeuN. Creemos que el método desarrollado en este estudio es simple y desempeñará un papel en el esclarecimiento de los mecanismos moleculares de la neurogénesis, así como la enfermedad neurodegenerativa.
