A linha celular P19 é conhecida por se diferenciar em neurônios. No entanto, o protocolo para diferenciação de neurônios da linha celular P19 às vezes é complicado. Este método nos permite realizar o experimento neurogênico de forma fácil de usar e expandir a possibilidade do uso da linha celular P19 para o futuro.
Para começar, manter as células P19 em meio de manutenção, compostas por DMEM, com 4,5 gramas por litro de glicose, suplementadas com soro bovino fetal de 10%, 100 unidades por penicilina mililitro e 100 unidades por estreptomicina mililitro. Incubar a cultura celular em um ambiente de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que as células sejam aproximadamente 80% confluentes. Remova o meio gasto do frasco de cultura celular e lave as células com dois mililitros de pbs sem cálcio e magnésio.
Adicione um mililitro de 0,25% de trippsina-EDTA para cobrir completamente a monocamada das células e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a três minutos. Sob um microscópio, verifique se todas as células estão separadas. Resuspenque as células em nove mililitros de meio de manutenção, a fim de neutralizar a trippsina.
Transfira as células para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes G e temperatura ambiente por cinco minutos para de pelotas nas células. Então, aspirar o supernatante sem perturbar a pelota. Resuspenda a pelota em 10 mililitros de meio de manutenção fresco e use um contador de células para determinar o número da célula de acordo com as instruções do fabricante.
Semente 20.000 células por centímetro quadrado em um novo frasco T-25 e somar até 10 mililitros de meio de manutenção. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a três dias. Para começar a digestão da trippsina, primeiro aspirar lentamente o supernaente e lavar as células com dois mililitros de cálcio e PBS livre de magnésio.
Em seguida, adicione um mililitro de 0,25% de trippsina EDTA às células e incuba-as a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a três minutos. Após a incubação, para neutralizar a trippsina, resuspennciou as células em nove mililitros de meio de diferenciação, composto por DMEM com alto nível de glicose e suplementado com soro bovino fetal de 5%, 100 unidades por penicilina mililitro e 100 unidades por estreptomicina mililitro. Transfira as células para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes G e temperatura ambiente por cinco minutos para de pelotas nas células.
Em seguida, aspire lentamente o supernaspe e resuspense a pelota em um mililitro de meio de diferenciação fresco sem RA. Use um contador de células para determinar o número do celular de acordo com as instruções do fabricante. Para geração agregada, comece adicionando 10 mililitros de meio de diferenciação, complementados com cinco microliters de RA a um prato de cultura de 100 mililitros e não tratados. Semente um milhão de células no prato de cultura e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois dias, a fim de promover a formação agregada.
Após a incubação, com uma pipeta de 10 mililitros, aspire o meio contendo os agregados e transfira-o para um tubo de 15 mililitros à temperatura ambiente. Aguarde 1,5 minutos para que os agregados se acomodem na parte inferior e depois descarte o supernante. Adicione 10 mililitros de meio de diferenciação fresco suplementado com RA de 0,5 micromolar. Semear suavemente os agregados em um novo prato de cultura de 100 milímetros, não tratado e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois dias.
Para começar, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir os agregados celulares para um tubo de 15 mililitros. Aguarde 1,5 minutos em temperatura ambiente para que os agregados se instalem na parte inferior e depois descarte o supernante. Lave os agregados com DMEM sem soro e antibióticos.
Aguarde que os agregados celulares se instalem na parte inferior, descarte o supernasce e adicione dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA. Incubar o tubo em um banho de água a 37 graus Celsius por 10 minutos, tocando a cada dois minutos para manter as células em suspensão. Em seguida, adicione quatro mililitros de meio de manutenção, a fim de parar a atividade de trippsina e pipeta para cima e para baixo 20 vezes usando uma pipeta de um mililitro.
Finalmente, centrifugar as células a 200 vezes G e temperatura ambiente por cinco minutos. Remova o supernatante e resuspense a pelota da célula em cinco mililitros de meio de manutenção. Use um contador de células para determinar o número da célula e proceda com o revestimento das células.
Às células de placa, primeiro adicione três mililitros por poço de meio de manutenção a uma placa de cultura de seis poços. Então, semeou as células a uma densidade de 500.000 por poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Seme as células em óculos de cobertura em uma placa de cultura de seis poços. Quando atingirem 20% de confluência, procederão à imunossuagem com anticorpo Anti-MAP2. Em seguida, isole o RNA e execute a transcrição reversa pcr para MAP2, NueN, OCT4, NANOG e um GAPDH.
Neste estudo, é introduzido um método simplificado para diferenciação neuronal. A linha celular P19 é cultivada em um prato de cultura não tratada com 5% FBS e 0,5 micromolar RA. Após quatro dias, os agregados celulares são dissociados com trippsina e semeados em uma placa de cultura celular aderente pelos próximos quatro dias. A eficiência deste método é avaliada pela comparação entre a análise rtpcr da linha celular P19 em estado indiferenciado e durante a neurogênese.
Os resultados mostram uma rápida diminuição da expressão de genes de pluripotência, como Oct4 e NANOG, e a regulação de genes marcadores neurnomal, como MAP2 e NeuN. Acreditamos que o método desenvolvido neste estudo é simples e desempenhará um papel na elucidação dos mecanismos moleculares da neurogênese, bem como da doença neurodegenerativa.
