Der Knoten und die Notochordalplatte sind wesentliche Organisatoren während der embryonalen Entwicklung der Maus. Heute werden wir zwei Techniken beschreiben, die von Entwicklungsbiologen verwendet werden, um diese Strukturen zu visualisieren und zu untersuchen. Im ersten Protokoll zeigen wir, wie man Diesperelektromikroskopie, SEM und im zweiten, ganzen Mount-Immunfluoreszenz durchführt.
Der Knoten und die Notochordalplatte sind vorübergehend auf der Oberfläche des Embryos am Embryonaltag E7.75 vorhanden, Betonung winzige Zilien projizieren nach außen, die ihre Identifizierung und Visualisierung durch SEM ermöglichen. In beiden Protokollen zeigen wir kritische Schritte im Umgang mit den relativ kleinen Mausembryonen auf und konzentrieren uns auf deren Übertragung und Route. Öffnen Sie zunächst den Bauch einer eingeschläferten schwangeren Maus durch die Haut und die Mesenterien.
Entfernen Sie die Gebärmutter mit Schere und feinen Zangen. Spülen Sie die Gebärmutter kurz in destilliertes Wasser und legen Sie sie in eine kleine Petrischale mit PBS. Verwenden Sie dann ein Sezieren Mikroskop und feine Zange, um die Gebärmuttermuskeln zu entfernen, um die einzelnen Decidui zu befreien.
Halten Sie unter dem Sezieren des Mikroskops jede Decidua mit einem Paar Zangen und verwenden Sie ein anderes Paar, um einen Längsschnitt mit voller Dicke zwischen dem roten und dem weißen Teil herzustellen. Machen Sie oberflächliche Perforationen vertikal entlang des weißen Teils der Dezidua, angrenzend an den Schnitt. Ziehen Sie dann die Decidua horizontal in zwei Hälften auseinander und entfernen Sie vorsichtig den Embryo aus dem weißen Teil der Decidua.
Danach übertragen Sie die Embryonen in eine neue Petrischale, die sterilgefilterte PBS enthält. Entfernen Sie Reicherts Membran von jedem Embryo, beginnend am ektoplazentalen Kegel. Für zukünftige Genotypisierung, entfernen Sie ein kleines Stück des Dottersacks.
Übertragen Sie die Embryonen unter einer chemischen Haube in ein Mikrozentrifugenrohr, das einen Fixitiven em-Grad enthält, der aus 2,5% Glutaraldehyd und sterilgefiltertem PBS besteht. Danach entfernen Sie den Fixitiven aus dem Rohr, ohne die Embryonen zu stören. Waschen Sie die Embryonen dreimal in sterilem, gefiltertem PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Dehydrieren Sie die Embryonen in einer Ethanol-Serie für jeweils fünf Minuten, wobei 50%70% und 85%Ethanol in PBS verdünnt werden. Dreimal in 100% Ethanol waschen. Lagern Sie Embryonen in 100% Ethanol bei 20 Grad Celsius, oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
Danach die Sticker in ein geeignetes Gefäß überführen und die verbleibende Flüssigkeit entfernen. Fügen Sie DEN Embryonen 30 Minuten lang HMDS und Ethanol im Verhältnis eins zu eins hinzu. Dann entfernen Sie die Flüssigkeit und fügen Sie reine HMDS für 30 Minuten.
Entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Embryonen mit einer Pipette und lassen Sie sie für 30 Minuten trocknen. Verwenden Sie eine kleine Bürste und doppelseitiges Klebeband, um die getrockneten Embryonen auf SEM-Stubs zu montieren, wobei die ventralen Seiten nach oben sind. Legen Sie die Stubs in eine Sputterbeschichtungsmaschine für Goldpartikelbeschichtung.
Einer der heikelsten Schritte im SEM-Teilchen ist die Montage der Embryonen in der richtigen Ausrichtung auf den Stub. Sobald der Embryo auf dem Band landet, kann die Ausrichtung nicht mehr geändert werden. Danach die beschichteten Stubs in ein SEM-Mikroskop geben, ein Vakuum auftragen und die embryonalen Knoten und notochordalen Plattenzellen mit Zilien beobachten.
Nach dem Entfernen der Embryonen bei E7.75, legen Sie sie in PBS Tween in einer Petrischale auf Eis. Übertragen Sie die Embryonen unter einer chemischen Haube in ein Mikrozentrifugenrohr, das eine fixative Lösung enthält. Danach entfernen Sie das Fixativ aus der Röhre, wobei Sie darauf achten, die Embryonen nicht zu berühren.
Dann waschen Sie die Embryonen dreimal in PBS, die 0,2%Triton X-100 enthalten, für 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem nussigen Shaker. Entfernen Sie die letzte Wäsche von den Embryonen und fügen Sie eine Blockierende Lösung hinzu, die PBS Triton enthält, mit 10% inaktiviertem Serum. Blockieren Sie die Embryonen für mindestens zwei Stunden auf einem Nutator bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie als Nächstes die Blockierung und fügen Sie etwa einen Milliliter Primärantikörper hinzu, der in der Blockierlösung verdünnt wird. Die Embryonen über Nacht auf einem Nutator bei vier Grad Celsius bebrüten. Entfernen Sie den primären Antikörper und speichern Sie ihn für die spätere Verwendung.
Dann spülen Sie die Embryonen zweimal mit PBS Triton ab. Und waschen Sie sie dreimal für 30 Minuten auf einem Nutator. Ersetzen Sie die Wäsche durch den verdünnten Blütenstand konjugierten Sekundärantikörper gegen die primäre Antikörper-Wirtsart.
Und über Nacht auf einem Nutator bei vier Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie dann den sekundären Antikörper und spülen Sie die Embryonen zweimal mit PBS Triton ab. Vor dem Waschen dreimal für 30 Minuten mit PBS Triton.
Ersetzen Sie die letzte Wäsche durch PBS Triton mit verdünntem Blütenstand konjugiertes Phalloidin und verdünntes DAPI und Flecken für eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann spülen Sie die Embryonen zweimal in PBS Triton. Und waschen Sie sie mit PBS Triton für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Danach ersetzen Sie das PBS Triton durch PBS und lassen Sie die Embryonen auf Eis. Bereiten Sie dann saubere, positiv geladene Dias, Deckelscheine und wässrige Glyzerin-basierte Montagemedien vor. Legen Sie zwei Stücke von klarem Klebeband 15 Millimeter voneinander voneinander auf der Folie.
Verwenden Sie dann unter dem Sezieren des Mikroskops eine modifizierte P200-Pipette, um einen Embryo auf das Dia zu bewegen. Mit feinen Zangen, machen Sie zwei volle Schnitte auf den Seiten seiten des Eigelbsacks, um den Embryo zu entfalten. Positionieren Sie dann den Embryo mit der ventralen Seite nach oben.
Fügen Sie dem Embryo 50 Mikroliter Montagemedien hinzu. Fügen Sie dann einen Tupfer mit Montagemedien in den Deckbedeckungsbeleg ein. Legen Sie es um die beiden Stücke Von Band, und senken Sie es langsam auf die Embryonen mit einer gebogenen Nadel.
Verwenden Sie ein saugfähiges Wischmittel, um überschüssige Montagemedien zu entfernen, wobei Sie darauf achten, den Deckelbeleg nicht zu bewegen. Verwenden Sie dann eine großzügige Menge Nagellack, um die Seiten des Deckelschlupfzu zu versiegeln. Schließlich verwenden Sie ein Raster-Konfokalmikroskop, um die Embryonen zu beobachten.
Es ist wichtig, den Deckbedeckungsschlupf nicht nach der Montage über die Embryonen zu bewegen, da er sie für die 3D-Visualisierung verzerren kann. Mittels Rasterelektronenmikroskopie wurde die Bildung des Knotens in Wildtyp und Streifen eines mutierten Mausembryons bei E7.75 beobachtet. Im Gegensatz zum grubenförmigen Knoten im Wildtyp zeigten die mutierten Embryonen einen abgeflachten und einen regulären Knoten und eine Knotenplatte.
Ganz jetzt zur Immunfluoreszenz wurde verwendet, um den Knoten und notochordalen Plattenbildung sänglichen Defekten in Strip 1 mutierten Embryonen auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die Daten zeigten, dass sie in den mutierten Embryonen abnormal und verkümmert waren. Der Knoten und die Nodalcortalplatte sind nur vorübergehend auf der Oberfläche des Embryos vorhanden, daher ist Timing für den Erfolg von SEM unerlässlich.
Zum Beispiel sind zwei bis vier Embryonen gut für die SEM-Analyse eines reifen Knotens mit langer Zilien. Die Reinheitreagenzien sind auch entscheidend für den Erfolg dieser Techniken, insbesondere bei der Untersuchung der Ultrastruktur durch SEM. Winzige Verunreinigungen, die am Embryo kleben, führen in der Regel zu riesigen Artefakten.
Wir glauben, dass diese beiden Techniken ergänzende Informationen über die Struktur des Knotens und der Nodalkortalplatte während der normalen Entwicklung und bei Mutanten geben, die Defekte bei der Bildung dieser Strukturen aufweisen.
