O nó e a placa notochordal são organizadores essenciais durante o desenvolvimento embrionário do rato. Hoje, descreveremos duas técnicas utilizadas por biólogos de desenvolvimento para visualizar e estudar essas estruturas. No primeiro protocolo, vamos demonstrar como realizar a microscopia eletro digitalização, SEM e no segundo, todo o montagem imunofluorescência.
O nó e a placa notochordal estão transitoriamente presentes na superfície do embrião no dia embrionário E7.75, enfatizando minúsculas cílias estão projetando para o exterior, que permitem sua identificação e visualização pela SEM. Em ambos os protocolos, demonstraremos passos críticos no manuseio dos embriões de camundongos relativamente pequenos e focaremos em como transferi-los e roteá-los. Para começar, abra o abdômen de um rato grávida eutanizado através da pele e dos mesenteries.
Usando tesouras e fórceps finos, remova o útero. Enxágüe o útero brevemente em água destilada e coloque-o em uma pequena placa de petri contendo PBS. Em seguida, use um microscópio dissecando e fórceps finos para remover os músculos uterinos para libertar o indivíduo decidui.
Sob o microscópio dissecando, segure cada decidua com um par de fórceps e use outro par para fazer uma incisão longitudinal e de espessura total entre a parte vermelha e a parte branca. Faça perfurações superficiais verticalmente ao longo da parte branca da decidua, contígua com a incisão. Em seguida, puxe a decidua horizontalmente em duas metades e remova cuidadosamente o embrião da parte branca da decidua.
Depois disso, transfira os embriões para uma nova placa de petri contendo PBS filtrado estéril. Remova a membrana de Reichert de cada embrião, começando no cone ectoplacental. Para genotipagem futura, remova um pequeno pedaço do saco de gema.
Sob uma capa química, transfira os embriões para um tubo de microcentrifuge contendo fixitive de grau EM composto de 2,5% de glutaraldeído e PBS filtrado estéril. Depois disso, remova o fixitivo do tubo sem perturbar os embriões. Lave os embriões três vezes em PBS estéril e filtrado por 15 minutos à temperatura ambiente.
Desidratar os embriões em uma série de etanol por cinco minutos cada, utilizando 50%70% e 85% de etanol diluídos na PBS. Lave três vezes em 100% etanol. Armazene embriões em 100% etanol a 20 graus Celsius, ou prossiga para o próximo passo.
Depois disso, transfira os embroyos para um vaso apropriado e remova qualquer líquido restante. Adicione HMDS e etanol em uma proporção de um para um para os embriões por 30 minutos. Em seguida, retire o líquido e adicione HMDS puro por 30 minutos.
Retire o líquido dos embriões com uma pipeta e deixe-os secar por 30 minutos. Use uma escova pequena e fita dupla face para montar os embriões secos em stubs SEM, com as laterais ventral para cima. Insira os stubs em uma máquina de revestimento de sputter para revestimento de partículas de ouro.
Um dos passos mais delicados da partícula SEM é a montagem dos embriões na orientação correta sobre o stub. Uma vez que o embrião pousa na fita, a orientação não pode mais ser alterada. Depois disso, coloque os stubs revestidos em um microscópio SEM, aplique um vácuo e observe os nós embrionários e células de placas notochordal com cílios.
Depois de remover os embriões em E7.75, coloque-os em PBS Tween em uma placa de petri no gelo. Sob uma capa química, transfira os embriões para um tubo de microcentrífuga contendo solução fixa. Depois disso, remova o fixador do tubo, tomando cuidado para não tocar nos embriões.
Em seguida, lave os embriões três vezes em PBS contendo 0,2% Triton X-100 por 5 minutos em temperatura ambiente em um shaker de nozes. Remova a última lavagem dos embriões e adicione a solução de bloqueio contendo PBS Triton, com soro inativado de 10% de calor. Bloqueie os embriões por pelo menos duas horas em um nutador a quatro graus Celsius.
Em seguida, remova o bloqueio e adicione aproximadamente um mililitro de anticorpo primário diluído na solução de bloqueio. Incubar os embriões durante a noite em um nutador a quatro graus Celsius. Remova o anticorpo primário e guarde-o para uso posterior.
Em seguida, enxágue os embriões com PBS Triton duas vezes. E lave-os três vezes por 30 minutos em um nutador. Substitua a lavagem pelo anticorpo secundário conjugado de floresnce diluído contra as espécies hospedeiras de anticorpos primários.
E incubar durante a noite em um nutador a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o anticorpo secundário e enxágue os embriões com PBS Triton duas vezes. Antes de lavar três vezes por 30 minutos com PBS Triton.
Substitua a última lavagem por PBS Triton contendo farooidina conjugada de floresnce diluída e DAPI diluída e mancha por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue os embriões duas vezes em PBS Triton. E lave-os com PBS Triton por 30 minutos em temperatura ambiente.
Depois disso, substitua o PBS Triton por PBS e deixe os embriões no gelo. Em seguida, prepare slides limpos e carregados positivamente, deslizes de cobertura e mídia de montagem baseada em glicerol aquoso. Coloque dois pedaços de fita clara 15 milímetros de distância um do outro no slide.
Em seguida, sob o microscópio de dissecação, use uma pipeta P200 modificada para mover um embrião para o slide. Usando fórceps finos, faça dois cortes completos nas laterais laterais do saco de gema para desdobrar o embrião. Em seguida, posicione o embrião com o lado ventral para cima.
Adicione 50 microliters de mídia de montagem ao embrião. Em seguida, adicione um pouco de mídia de montagem ao deslizamento de cobertura. Coloque-o entrelaçando os dois pedaços de fita, e abaixe-o lentamente sobre os embriões usando uma agulha dobrada.
Use uma limpeza absorvente para remover o excesso de mídia de montagem, tomando cuidado para não mover o deslizamento da tampa. Em seguida, use uma quantidade generosa de esmalte para selar as laterais do deslizamento da tampa. Finalmente, use um microscópio confocal de varredura para observar os embriões.
É fundamental não mover o deslizamento da tampa depois de montá-lo sobre os embriões, porque pode distorcê-los para visualização 3D. Usando microscopia eletrônica de varredura, observou-se a formação do nó em embriões de camundongos mutantes no E7.75. Ao contrário do nó em forma de poço no tipo selvagem, os embriões mutantes exibiam um nó achatado e um nó regular e uma placa nodalcordal.
Todo agora a imunofluorescência foi usado para estudar os defeitos de formação de placas noíde e notochordal em embriões mutantes da Strip 1 no nível celular. Os dados mostraram que eram anormais e atrofiados nos embriões mutantes. O nó e a placa nodalcortal estão apenas transitoriamente presentes na superfície do embrião, portanto o tempo é essencial para o sucesso do SEM.
Por exemplo, dois a quatro embriões de somite são bons para a análise SEM de um nó maduro com cílios longos. Os reagentes de pureza também são essenciais para o sucesso dessas técnicas, especialmente na sondagem da ultraestrutura pela SEM. Pequenas impurezas que grudam no embrião geralmente resultam em artefatos enormes.
Acreditamos que essas duas técnicas dão informações complementares sobre a estrutura do nódulo e da placa nodalcortal durante o desenvolvimento normal e em mutantes que mostram defeitos na formação dessas estruturas.
