노드 와 notochordal 플레이트는 마우스 배아 발달 중에 필수 주최자입니다. 오늘, 우리는 발달 생물학자가 이 구조물을 구상하고 연구하기 위하여 이용된 2개의 기술을 기술할 것입니다. 첫 번째 프로토콜에서는, 우리는 스캐닝 전기 현미경 검사법, SEM 및 두 번째, 전체 마운트 면역 형광을 수행하는 방법을 보여줍니다.
노드와 notochordal 플레이트는 배아 일 E7.75에서 배아의 표면에 일시적으로 존재하며, 작은 섬모가 외부에 투사되어 SEM에 의한 식별 및 시각화를 허용합니다. 두 프로토콜 모두에서, 우리는 상대적으로 작은 마우스 배아를 처리하는 중요한 단계를 설명하고 전송하고 라우팅하는 방법에 초점을 맞출 것입니다. 시작하려면, 피부와 메자기를 통해 안락사 임신 마우스의 복부를 엽니 다.
가위와 미세한 집게를 사용하여 자궁을 제거합니다. 자궁을 증류수에 잠깐 헹구고 PBS가 들어있는 작은 페트리 접시에 놓습니다. 그런 다음 해부 현미경과 미세 한 집게를 사용하여 자궁 근육을 제거하여 개별 데시두이를 해방시하십시오.
해부 현미경에서, 집게의 쌍으로 각 데시두아를 잡고 빨간색 부분과 흰색 부분 사이의 세로, 전체 두께 절개를 만들기 위해 다른 쌍을 사용합니다. 절개와 인접한 데시두아의 흰색 부분을 따라 수직으로 피상천을 만듭니다. 그런 다음 데시두아를 수평으로 두 부분으로 끌어당기고 데시두아의 흰색 부분에서 배아를 조심스럽게 제거합니다.
그 후, 배아를 멸균 여과 PBS를 포함하는 새로운 페트리 접시로 옮는다. 각 배아에서 라이허트의 멤브레인을 제거하여 자궁 절제콘에서 시작합니다. 미래의 지노티핑을 위해, 노른자 낭의 작은 조각을 제거합니다.
화학 후드 하에서, 2.5%의 글루타랄데히드 및 멸균 여과 PBS로 구성된 EM 급 고정제를 함유한 미세원심분리기 튜브로 배아를 이송한다. 그 후 배아를 방해하지 않고 튜브에서 고정을 제거합니다. 배아를 멸균, 여과된 PBS에서 실온에서 15분 동안 세 번 세척합니다.
PBS에서 희석된 50%70%와 85%에탄올을 사용하여 각각 5분 동안 에탄올 계열에서 배아를 탈수합니다. 100% 에탄올로 세 번 씻으시면 됩니다. 배아를 섭씨 20도에서 100% 에탄올에 저장하거나 다음 단계로 진행하십시오.
그 후, 엠브로요스를 적절한 용기로 옮기고 남은 액체를 제거합니다. 30 분 동안 배아에 1 대 1의 비율로 HMDS와 에탄올을 추가합니다. 그런 다음 액체를 제거하고 30 분 동안 순수 HMDS를 추가하십시오.
파이펫으로 배아에서 액체를 제거하고 30 분 동안 건조 할 수 있습니다. 작은 브러시와 양면 테이프를 사용하여 SEM 스텁에 말린 배아를 장착하고 복부 측면을 위로 올릴 수 있습니다. 금 입자 코팅을 위해 스퍼터 코팅 기계에 스텁을 삽입합니다.
SEM 입자에서 가장 섬세한 단계 중 하나는 배아를 스텁에 올바른 방향으로 장착하는 것입니다. 배아가 테이프에 닿으면 방향을 더 이상 변경할 수 없습니다. 그 후, 코팅된 스텁을 SEM 현미경으로 배치하고, 진공을 적용하고, 배아 노드와 섬모를 가진 노토코드 플레이트 세포를 관찰한다.
E7.75에서 배아를 제거 한 후, 얼음에 페트리 접시에 PBS Tween에 배치합니다. 화학 적 후드에서, 고정 용액을 포함하는 미세 원심 분리기 튜브로 배아를 전송. 그 후, 배아를 만지지 않도록 주의하여 튜브에서 고정을 제거하십시오.
이어서, 견과류 셰이커에서 실온에서 0.2%트리톤 X-100을 함유한 PBS에서 배아를 3회 세척한다. 배아에서 마지막 세척을 제거하고 10 %의 열 비활성화 혈청과 PBS 트리톤을 포함하는 차단 용액을 추가합니다. 섭씨 4도에서 영양사에 적어도 2 시간 동안 배아를 차단합니다.
다음으로, 차단을 제거하고 차단 용액에 희석된 1차 항체의 약 1밀리리터를 추가한다. 섭씨 4도에서 영양사에 하룻밤 동안 배아를 배양하십시오. 1 차적인 항체를 제거하고 나중에 사용하기 위해 저장하십시오.
그런 다음 PBS 트리톤으로 배아를 두 번 헹구는 다. 그리고 견과류에 30 분 동안 세 번 씻으시면. 1차 항체 숙주 종에 대하여 희석된 플로레스시공 컨쥬게이드 이차 항체로 세척을 대체한다.
그리고 섭씨 4도에서 영양사에 하룻밤 을 배양. 그런 다음, 이차 항체를 제거하고 PBS 트리톤으로 배아를 두 번 헹구는다. PBS 트리톤으로 30 분 동안 세 번 세척하기 전에.
마지막 세척을 희석된 플로레스시펜싱을 함유한 PBS 트리톤으로 교체하고 실온에서 1시간 동안 DAPI와 얼룩을 희석시 보세요. 그런 다음 PBS 트리톤에서 배아를 두 번 헹구는 다. 그리고 실온에서 30 분 동안 PBS 트리톤으로 씻으시면 씻으실 수 있습니다.
그 후 PBS 트리톤을 PBS로 교체하고 배아를 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 깨끗하고 양전하의 슬라이드, 커버 슬립 및 수성 글리세롤 기반 마운팅 미디어를 준비합니다. 슬라이드에 서로 떨어져 15 밀리미터 투명 테이프의 두 조각을 배치합니다.
그런 다음 해부 현미경으로 변형된 P200 파이펫을 사용하여 배아를 슬라이드로 이동시합니다. 미세 한 집게를 사용 하 여, 배아를 전개 하는 노른자 낭의 측면에 두 개의 전체 컷을 확인 합니다. 그런 다음, 복부 측으로 배아를 배치합니다.
배아에 50 마이크로리터의 장착 매체를 추가합니다. 그런 다음 커버 슬립에 장착 용지를 넣습니다. 두 개의 테이프를 걸치고 구부러진 바늘을 사용하여 배아에 천천히 낮추습니다.
흡수성 와이프를 사용하여 커버 슬립을 움직이지 않도록 주의하여 과도한 장착 매체를 제거하십시오. 그런 다음, 커버 슬립의 측면을 밀봉 하기 위해 매니큐어의 관대 한 금액을 사용 하 여. 마지막으로, 배아를 관찰하기 위해 스캐닝 공초점 현미경을 사용합니다.
3D 시각화를 위해 커버를 왜곡할 수 있기 때문에 배아 위에 장착한 후 커버 슬립을 이동하지 않는 것이 중요합니다. 주사 전자 현미경 을 사용하여, 야생 형노드의 형성및 E7.75에서 하나의 돌연변이 마우스 배아를 스트립 관찰하였다. 야생 형의 피트 모양 노드와는 달리 돌연변이 배아는 평평하고 일반 노드 및 노달코탈 플레이트를 표시했습니다.
면역형광에 대한 전체는 세포 수준에서 스트립 1 돌연변이 배아에서 노드 및 노토코드 플레이트 형성 결함을 연구하기 위해 사용되었다. 데이터는 돌연변이 배아에서 비정상적이고 기절했다는 것을 보여주었습니다. 노드와 무달음판은 배아의 표면에 일시적으로만 존재하므로 타이밍은 SEM의 성공을 위해 필수적입니다.
예를 들면, 2-4개의 somite 태아는 긴 섬모를 가진 성숙한 노드의 SEM 분석에 좋다. 순도 시약은 특히 SEM에 의한 초구조를 탐구하는 데 있어 이러한 기술의 성공을 위해 필수적입니다.
우리는 이 두 기술이 정상적인 발달 도중 노드와 결점 판의 구조와 이러한 구조물의 형성에 있는 결점을 보여주는 돌연변이에 상호 보완적인 정보를 준다고 믿습니다.
