El nodo y la placa notochordal son organizadores esenciales durante el desarrollo embrionario de ratón. Hoy describiremos dos técnicas utilizadas por los biólogos del desarrollo para visualizar y estudiar estas estructuras. En el primer protocolo, demostraremos cómo realizar la electro microscopía de escaneo, SEM y en el segundo, inmunofluorescencia de montaje completo.
El nodo y la placa notochordal están presentes transitoriamente en la superficie del embrión en el día embrionario E7.75, énfasis pequeños cilios se proyectan hacia el exterior, lo que permite su identificación y visualización por SEM. En ambos protocolos, demostraremos pasos críticos en el manejo de los embriones de ratón relativamente pequeños y nos centraremos en cómo transferirlos y enrutarlos. Para empezar, abre el abdomen de un ratón embarazada eutanizado a través de la piel y los mesenterios.
Usando tijeras y fórceps finos, retire el útero. Enjuague brevemente el útero en agua destilada y colóquelo en un pequeño plato de petri que contenga PBS. Luego, usa un microscopio diseccionado y fórceps finos para eliminar los músculos uterinos para liberar el decidui individual.
Bajo el microscopio diseccionado, sostenga cada decidua con un par de fórceps y use otro par para hacer una incisión longitudinal de espesor completo entre la parte roja y la parte blanca. Realizar perforaciones superficiales verticalmente a lo largo de la parte blanca de la decidua, contigua con la incisión. Luego, separa la decidua horizontalmente en dos mitades y retira cuidadosamente el embrión de la parte blanca de la decidua.
Después de esto, transfiera los embriones a un nuevo plato de petri que contenga PBS filtrado estéril. Retire la membrana de Reichert de cada embrión, comenzando en el cono ectoplacental. Para el genotipado futuro, retire un pequeño pedazo del saco de yema.
Bajo una capucha química, transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga que contenga fijación de grado EM compuesto por 2,5% de glutaraldehído y PBS filtrado estéril. Después de esto, retire el fixitivo del tubo sin molestar los embriones. Lave los embriones tres veces en PBS estéril y filtrado durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Deshidratar los embriones en una serie de etanol durante cinco minutos cada uno, utilizando 50%70% y 85%etanol diluido en PBS. Lavar tres veces en 100% etanol. Almacene los embriones en 100% etanol a 20 grados centígrados, o continúe con el siguiente paso.
Después de esto, transfiera los relieves a un recipiente apropiado y retire cualquier líquido restante. Añadir HMDS y etanol en una proporción de uno a uno a los embriones durante 30 minutos. A continuación, retire el líquido y agregue HMDS puro durante 30 minutos.
Retire el líquido de los embriones con una pipeta y dé y deje que se sequen durante 30 minutos. Utilice un cepillo pequeño y cinta adhesiva de doble cara para montar los embriones secos en los talones SEM, con los lados ventrales hacia arriba. Inserte los talones en una máquina de recubrimiento de pulverización para el recubrimiento de partículas de oro.
Uno de los pasos más delicados de la partícula SEM es montar los embriones en la orientación correcta en el talón. Una vez que el embrión aterriza en la cinta, la orientación ya no se puede cambiar. Después de esto, coloque los talones recubiertos en un microscopio SEM, aplique un vacío y observe los ganglios embrionarios y las células de placa notochordal con cilios.
Después de extraer los embriones en E7.75, colóquelos en PBS Tween en un plato de petri sobre hielo. Bajo una capucha química, transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga que contenga solución fijativa. Después de esto, retire el fijador del tubo, teniendo cuidado de no tocar los embriones.
A continuación, lave los embriones tres veces en PBS que contenga 0,2%Tritón X-100 durante 5 minutos a temperatura ambiente en una coctelera nutrida. Retire el último lavado de los embriones y añada una solución de bloqueo que contenga PBS Triton, con un 10% de suero inactivado por calor. Bloquee los embriones durante al menos dos horas en un nutator a cuatro grados centígrados.
A continuación, retire el bloqueo y añada aproximadamente un mililitro de anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo. Incubar los embriones durante la noche en un nutator a cuatro grados centígrados. Retire el anticuerpo primario y guárdelo para su uso posterior.
Luego, enjuague los embriones con PBS Triton dos veces. Y lávelos tres veces durante 30 minutos en un nuttor. Sustituya el lavado por el anticuerpo secundario conjugado de florescencia diluida contra la especie huésped principal de anticuerpos.
Y incubar durante la noche en un nutator a cuatro grados centígrados. A continuación, retire el anticuerpo secundario y enjuague los embriones con PBS Triton dos veces. Antes de lavar tres veces durante 30 minutos con PBS Triton.
Sustituya el último lavado por PBS Triton que contenga faloide conjugado de florescencia diluida y DAPI diluido y manche durante una hora a temperatura ambiente. Luego, enjuague los embriones dos veces en PBS Triton. Y lávelos con PBS Triton durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después de esto, reemplace el PBS Triton con PBS y deje los embriones en hielo. A continuación, prepare diapositivas limpias y cargadas positivamente, resbalones de cubierta y medios de montaje acuosos a base de glicerol. Coloque dos piezas de cinta transparente a 15 milímetros de distancia entre sí en la diapositiva.
Luego, bajo el microscopio de disección, utilice una pipeta P200 modificada para mover un embrión a la diapositiva. Usando fórceps finos, haz dos cortes completos en los lados laterales del saco de yema para desplegar el embrión. A continuación, coloque el embrión con el lado ventral hacia arriba.
Añadir 50 microlitros de medios de montaje al embrión. A continuación, agregue un toque de soporte de montaje al resbalón de la cubierta. Colóquelo a lo medio de los dos trozos de cinta adhesiva y bájalo lentamente sobre los embriones usando una aguja doblada.
Utilice una toallita absorbente para eliminar el exceso de medios de montaje, teniendo cuidado de no mover el resbalón de la cubierta. Luego, usa una generosa cantidad de esmalte de uñas para sellar los lados del resbalón de la cubierta. Por último, utilice un microscopio confocal de exploración para observar los embriones.
Es fundamental no mover el resbalón de la cubierta después de montarlo sobre los embriones, ya que puede distorsionarlos para la visualización 3D. Usando microscopía electrónica de barrido, se observó la formación del nodo en un tipo salvaje y despojar a un embrion de ratón mutante en E7.75. A diferencia del nodo en forma de pozo en el tipo salvaje, los embriones mutantes mostraban un nodo aplanado y un nodo regular y una placa nodalcordal.
Todo ahora a la inmunofluorescencia se utilizó para estudiar los defectos de formación de placas de nodo y notochordal en embriones mutantes Strip 1 a nivel celular. Los datos mostraron que eran anormales y atrofiados en los embriones mutantes. El nodo y la placa nodalcortal sólo están presentes transitoriamente en la superficie del embrión, por lo tanto, la sincronización es esencial para el éxito del SEM.
Por ejemplo, dos a cuatro embriones de somita son buenos para el análisis SEM de un nodo maduro con cilios largos. Los reactivos de pureza también son esenciales para el éxito de estas técnicas, especialmente en el sondeo de la ultraestructura por SEM. Pequeñas impurezas que se adhieren al embrión generalmente resultan en enormes artefactos.
Creemos que estas dos técnicas proporcionan información complementaria sobre la estructura del nodo y la placa nodalcortal durante el desarrollo normal y en mutantes que muestran defectos en la formación de estas estructuras.
