הצומת ואת הצלחת notochordal הם מארגנים חיוניים במהלך התפתחות עוברית העכבר. כיום, נתאר שתי טכניקות המשמשות ביולוגים התפתחותיים כדי לדמיין וללמוד מבנים אלה. בפרוטוקול הראשון, נדגים כיצד לבצע סריקת מיקרוסקופיה אלקטרו, SEM ובשנייה, immunofluorescence הר שלם.
הצומת והצלחת הנוטנורדית נמצאים באופן ארעי על פני השטח של העובר ביום העוברי E7.75, דגש על גירויים זעירים מקרינים מבחוץ, המאפשרים זיהוים והדמיה שלהם על ידי SEM. בשני הפרוטוקולים, נדגים צעדים קריטיים בטיפול בעוברים הקטנים יחסית של העכבר ו נתמקד כיצד להעביר ולתדרך אותם. כדי להתחיל, לפתוח את הבטן של עכבר בהריון המתת הריון דרך העור ואת mesenteries.
באמצעות מספריים ומדפים עדין, להסיר את הרחם. שוטפים את הרחם לזמן קצר במים מזוקקים ומ מניחים אותו בצלחת פטרי קטנה המכילה PBS. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ ניתוח ומטחנים עדין כדי להסיר את שרירי הרחם כדי לשחרר את decidui הפרט.
מתחת למיקרוסקופ הניתוח, החזיקו כל דציבואה עם זוג מדפים ולהשתמש בזוג אחר כדי לבצע חתך אורך ועובי מלא בין החלק האדום לחלק הלבן. בצע ניקובים שטחיים אנכית לאורך החלק הלבן של decidua, רציף עם החתך. לאחר מכן, למשוך את decidua לגזרים אופקית לתוך שני חצאים בזהירות להסיר את העובר מהחלק הלבן של decidua.
לאחר מכן, להעביר את העוברים לצלחת פטרי חדשה המכילה PBS מסונן סטרילי. הסר את הממברנה של רייכרט מכל עובר, החל בקון האקטו-פלסנטי. עבור genotyping בעתיד, להסיר חתיכה קטנה של שם החלמון.
תחת מכסה המנוע הכימי, להעביר את העוברים לצינור microcentrifuge המכיל תיקון כיתה EM מורכב 2.5% glutaraldehyde ו PBS מסונן סטרילי. לאחר מכן, להסיר את fixitive מהצינור מבלי להפריע לעוברים. לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBS סטרילי, מסונן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לייבש את העוברים בסדרת אתנול במשך חמש דקות כל אחד, באמצעות 50%70% ו 85% אתנול מדולל PBS. לשטוף שלוש פעמים ב100% אתנול. לאחסן עוברים ב 100% אתנול ב 20 מעלות צלזיוס, או להמשיך לשלב הבא.
לאחר מכן, להעביר את embroyos לכלי מתאים ולהסיר את כל הנוזלים שנותרו. מוסיפים HMDS ואתנול ביחס של אחד לאחד לעוברים במשך 30 דקות. לאחר מכן, להסיר את הנוזל ולהוסיף HMDS טהור במשך 30 דקות.
מוציאים את הנוזל מהעוברים עם פיפטה ומאפשרים להם להתייבש במשך 30 דקות. השתמש במברשת קטנה וקלטת דו צדדית כדי להרכיב את העוברים המיובשים על סטאפים SEM, עם הצדדים הגחון למעלה. הכנס את הדגמים למכונת ציפוי sputter עבור ציפוי חלקיקי זהב.
אחד הצעדים העדינים ביותר בחלקיק SEM הוא הרכבה של העוברים בכיוון הנכון על גבי התותב. ברגע שהעובר נוחת על הקלטת, לא ניתן לשנות את האוריינטציה יותר. לאחר מכן, מניחים את הסנובים המצופים במיקרוסקופ SEM, מיישמים ואקום, ומתבוננים בצמתים העובריים ותאי הלוחות הנוטוריים עם ה- Cilia.
לאחר הסרת העוברים ב E7.75, מניחים אותם PBS Tween בצלחת פטרי על קרח. מתחת למכסה המנוע הכימי, מעבירים את העוברים לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל פתרון מתקן. לאחר מכן, להסיר את התיקון מן הצינור, דואג לא לגעת בעוברים.
לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBS המכיל 0.2% טריטון X-100 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר אגוזי. הסר את הכביסה האחרונה מן העוברים ולהוסיף פתרון חסימה המכיל PBS טריטון, עם 10% חום סרום מושבת. חוסמים את העוברים לפחות שעתיים על מטור ב-4 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, להסיר את החסימה ולהוסיף כמיליליטר של נוגדן ראשוני מדולל בתתכנון חסימה. להתבגר העוברים לילה על מטור ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הנוגדן העיקרי ולשמור אותו לשימוש מאוחר יותר.
לאחר מכן, לשטוף את העוברים עם PBS טריטון פעמיים. ולשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות על מטורף. החלף את הכביסה בנוגדן המשני המדולל נגד המין המארח העיקרי של הנוגדנים.
וחגירה לילה על אגוז בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף את העוברים עם PBS טריטון פעמיים. לפני כביסה שלוש פעמים במשך 30 דקות עם PBS טריטון.
החלף את הכביסה האחרונה עם PBS טריטון המכיל פלודין מדולל מצומד ו DAPI מדולל וכתם במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את העוברים פעמיים ב PBS טריטון. ולשטוף אותם עם PBS טריטון במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להחליף את טריטון PBS עם PBS ולהשאיר את העוברים על קרח. לאחר מכן הכינו שקופיות נקיות, טעונות באופן חיובי, תלושי כיסוי ומדיית הרכבה מיקווית המבוססת על גליצרול. מניחים שתי חתיכות של קלטת ברורה 15 מילימטרים זה מזה על השקופית.
לאחר מכן, תחת המיקרוסקופ המפעל, השתמש בפיפלט P200 שונה כדי להעביר עובר לשקופית. באמצעות מלקחיים עדין, לעשות שני חתכים מלאים על הצדדים הצדדיים של שם החלמון כדי לפתוח את העובר. לאחר מכן, למקם את העובר עם הצד הגחון למעלה.
הוסף 50 מיקרוליטרים של מדיה הרכבה לעובר. לאחר מכן, הוסף dab של מדיה הרכבה לתק השער. מניחים אותו על שתי חתיכות של סרט הדבקה, ולהוריד אותו לאט על העוברים באמצעות מחט כפופה.
השתמש במגבון סופג כדי להסיר מדיית הרכבה עודפת, תוך כדי דאגה לא להזיז את פתק הכיסוי. לאחר מכן, השתמש בכמות נדיבה של לק כדי לאטום את הצדדים של להחליק את הכיסוי. לבסוף, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל סריקה כדי להתבונן בעוברים.
זה קריטי לא להזיז את החלק הכיסוי לאחר הרכבה אותו על העוברים, כי זה יכול לעוות אותם עבור הדמיה 3D. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה, היווצרות הצומת בסוג פראי ולהפשיט עוברי עכבר מוטנט אחד ב E7.75 נצפתה. שלא כמו הצומת בצורת בור בסוג הבר, העוברים המוטנטים הציגו צומת שטוח וצומת רגיל וצלחת nodalcordal.
שלם עכשיו כדי immunofluorescence שימש כדי ללמוד את הצומת ואת פגמים היווצרות לוח notochordal ברצועה 1 עוברים מוטנטים ברמה התאית. הנתונים הראו שהם היו חריגים ופעלו בעוברים המוטנטים. הצומת וצלחת הנודלקורטלית נמצאים רק באופן חולף על פני השטח של העובר, ולכן התזמון חיוני להצלחת SEM.
לדוגמה, שניים עד ארבעה עוברים somite טובים לניתוח SEM של צומת בוגר עם ריסים ארוכים. Reagents טוהר הוא גם חיוני להצלחת טכניקות אלה, במיוחד בחיקור אולטרה מבנה על ידי SEM. זיהומים זעירים כי מקל על העובר בדרך כלל לגרום חפצים ענקיים.
אנו מאמינים כי שתי טכניקות אלה לתת מידע משלים על המבנה של הצומת ואת הלוח nodalcortal במהלך התפתחות נורמלית מוטציות להראות פגמים בהיווצרות של מבנים אלה.
