Узел и notochordal пластины являются основными организаторами во время мыши эмбрионального развития. Сегодня мы опишем два метода, используемых биологами-разработками для визуализации и изучения этих структур. В первом протоколе мы продемонстрируем, как выполнять сканирование электро микроскопии, SEM и во втором, цельном горе иммунофторесценции.
Узел и нонохордальная пластина временно присутствуют на поверхности эмбриона в эмбриональный день E7.75, акцент крошечные реснички проецируются на улицу, которые позволяют их идентификации и визуализации SEM. В обоих протоколах мы продемонстрируем важные шаги в обработке относительно небольших эмбрионов мыши и сосредоточимся на том, как их перенести и маршрутировать. Для начала откройте брюшную полость усыпанной беременной мыши через кожу и мезентерии.
Используя ножницы и тонкие миппы, удалите матку. Промыть матку кратко в дистиллированной воде и поместить его в небольшой чашке Петри, содержащей PBS. Затем используйте рассечение микроскопа и тонкой типсы, чтобы удалить мышцы матки, чтобы освободить индивидуальный decidui.
Под рассеченным микроскопом держите каждый decidua с парой типсов и используйте другую пару, чтобы сделать продольный, полный разрез толщины между красной и белой частью. Сделайте поверхностные перфорации вертикально вдоль белой части decidua, смежных с разрезом. Затем потяните decidua друг от друга горизонтально на две половины и тщательно удалить эмбрион из белой части decidua.
После этого перенесите эмбрионы в новую чашку Петри, содержащую стерильный фильтрованный PBS. Удалите мембрану Райхерта из каждого эмбриона, начиная с эктопласентального конуса. Для будущего genotyping, удалить небольшой кусочек желточного мешка.
Под химическим капотом перенесите эмбрионы в микроцентрифуговую трубку, содержащую фикситивный класс EM, состоящий из 2,5%glutaraldehyde и стерильной фильтрованной PBS. После этого удалите фиксатор из трубки, не нарушая эмбрионов. Вымойте эмбрионы три раза в стерильной, фильтруемой PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.
Обезвоживать эмбрионы в серии этанола в течение пяти минут каждый, используя 50%70%и 85%этанола, разбавленного в PBS. Вымойте три раза в 100% этанола. Храните эмбрионы в 100% этанола при 20 градусах по Цельсию, или перейти к следующему шагу.
После этого перенесите эмбройос в соответствующий сосуд и удалите оставшуюся жидкость. Добавьте HMDS и этанол в соотношении один к одному с эмбрионами в течение 30 минут. Затем удалите жидкость и добавьте чистый HMDS в течение 30 минут.
Удалить жидкость из эмбрионов с пипеткой и дать им высохнуть в течение 30 минут. Используйте небольшую кисть и двустороннюю ленту, чтобы смонтировать высушенные эмбрионы на заглушках SEM, с вентральными сторонами вверх. Вставьте заглушки в машину покрытия распыления для покрытия частиц золота.
Одним из самых деликатных шагов в частице SEM является монтаж эмбрионов в правильной ориентации на заглушку. Как только эмбрион приземляется на ленту, ориентация больше не может быть изменена. После этого поместите покрытые заглушки в sem микроскоп, нанесите вакуум, и наблюдать эмбриональных узлов и notochordal клеток пластины с ресничками.
После удаления эмбрионов на E7.75, поместите их в PBS Tween в чашке Петри на льду. Под химическим капотом перенесите эмбрионы в микроцентрифуговую трубку, содержащую фиксаторный раствор. После этого удалите фиксатор из трубки, заботясь о том, чтобы не трогать эмбрионы.
Затем, мыть эмбрионы три раза в PBS, содержащий 0,2%Triton X-100 в течение 5 минут при комнатной температуре на nutating шейкер. Удалите последнюю стирку из эмбрионов и добавьте блокирующий раствор, содержащий PBS Triton, с 10%тепловой инактивированной сывороткой. Блок эмбрионов, по крайней мере два часа на nutator при четырех градусах по Цельсию.
Затем удалите блокировку и добавьте примерно один миллилитр первичного антитела, разбавленного блокирующим раствором. Инкубировать эмбрионы на ночь на nutator при четырех градусах по Цельсию. Удалите первичное антитело и сохраните его для более длительного использования.
Затем, промыть эмбрионы с PBS Тритон в два раза. И мыть их три раза в течение 30 минут на nutator. Замените стирку разбавленной флуоресцентностью, спрягая вторичные антитела против первичного вида-хозяина антител.
И инкубировать на ночь на nutator при четырех градусах по Цельсию. Затем удалите вторичное антитело и промойте эмбрионы с помощью PBS Triton дважды. Перед стиркой три раза в течение 30 минут с PBS Тритон.
Замените последнюю стирку PBS Triton, содержащую разбавленный конъюгированный фаллоидин и разбавленный DAPI и пятно в течение одного часа при комнатной температуре. Затем, промыть эмбрионы дважды в PBS Тритон. И мыть их с PBS Тритон в течение 30 минут при комнатной температуре.
После этого замените PBS Triton на PBS и оставьте эмбрионы на льду. Затем подготовьтесь чистые, положительно заряженные слайды, крышки скользит и aqueous глицерол основе монтажа средств массовой информации. Поместите два куска ясной ленты 15 миллиметров друг от друга на слайде.
Затем, под рассеченным микроскопом, используйте модифицированную трубу P200 для перемещения эмбриона на слайд. Используя тонкие миппы, сделайте два полных разреза на боковых сторонах желточного мешка, чтобы развернуть эмбрион. Затем распоимить эмбрион с брюшной стороной вверх.
Добавьте к эмбриону 50 микролитров монтажных средств массовой информации. Затем добавьте мазок монтажных средств массовой информации на крышку скольжения. Поместите его трансграничных двух кусков ленты, и опустите его медленно на эмбрионы с помощью изогнутой иглы.
Используйте абсорбативную салфетку, чтобы удалить излишки монтажных средств, заботясь о том, чтобы не перемещать крышку скольжения. Затем используйте щедрое количество лака для ногтей, чтобы запечатать стороны крышки скольжения. Наконец, используйте сканирующий конфокальный микроскоп для наблюдения за эмбрионами.
Очень важно не перемещать крышку скольжения после монтажа его над эмбрионами, потому что это может исказить их для 3D визуализации. С помощью сканирующей электронной микроскопии наблюдалось образование узла в диком типе и полоса одного мутантного эмбриона мыши на E7.75. В отличие от ямообразного узла в диком типе, эмбрионы-мутанты показали сплющенный и обычный узел и узелкорда.
Всего в настоящее время для иммунофторесценции был использован для изучения узла и notochordal дефектов образования пластин в полосе 1 мутант эмбрионов на клеточном уровне. Данные показали, что они были ненормальными и замедлился в мутант эмбрионов. Узел и узелкордальная пластина присутствуют только на поверхности эмбриона, поэтому время имеет важное значение для успеха SEM.
Например, два-четыре эмбриона сомита хороши для SEM-анализа зрелого узла с длинными реснички. Реагенты чистоты также необходимы для успеха этих методов, особенно в зондировании ультраструктуры SEM. Крошечные примеси, которые прилипают к эмбриону, обычно приводят к огромным артефактам.
Мы считаем, что эти два метода дают дополнительную информацию о структуре узла и нордкорта пластины во время нормального развития и у мутантов, которые показывают дефекты в формировании этих структур.
