ノードと脊索プレートは、マウス胚発生時に不可欠なオーガナイザーです。今日、我々は、これらの構造を可視化し、研究するために、発達生物学者によって使用される2つの技術を説明する。第1のプロトコルでは、走査型電気顕微鏡、SEM、第2のマウント免疫蛍光全体の方法を示します。
ノードと脊索板は、胚の日E7.75で胚の表面に一時的に存在し、強調小さな繊毛が外部に投影され、SEMによる同定と視覚化が可能になる。どちらのプロトコルでも、比較的小さなマウス胚を処理する上で重要なステップを示し、それらを転送してルーティングする方法に焦点を当てます。まず、安楽死させた妊娠マウスの腹部を皮膚と腸間腸を通して開く。
はさみと細かい鉗子を使って、子宮を取り除きます。蒸留水で子宮を短時間洗い流し、PBSを含む小さなシャーレに入れます。その後、解剖顕微鏡と細かい鉗子を使用して子宮筋を取り除き、個々のデシドゥイを解放する。
解剖顕微鏡の下で、各デシドゥアを鉗子で保持し、別のペアを使用して、赤い部分と白い部分の間に縦方向の完全な厚さの切開を行います。デシドゥアの白い部分に沿って垂直に表面的なパーホレーションを行い、切開に隣接します。次に、デシドゥアを水平に2つの半分に引き離し、デシドゥアの白い部分から慎重に胚を取り除きます。
この後、胚を滅菌濾過PBSを含む新しいシャーレに移す。各胚から、外胎盤コーンから始まるReichertの膜を取り除きます。将来のジェノタイピングのために、黄身嚢の小片を取り除きます。
化学フードの下で、2.5%グルタルアルデヒドと無菌濾過PBSで構成されるEMグレードの固定を含むマイクロ遠心分離チューブに胚を移します。この後、胚を邪魔することなくチューブから固定を取り除きます。胚を無菌で3回洗浄し、室温で15分間PBSを濾過した。
胚をエタノール系列でそれぞれ5分間脱水し、50%70%および85%エタノールをPBSで希釈した。100%エタノールで3回洗浄する。胚を摂氏20度で100%エタノールに保存するか、次のステップに進みます。
その後、適切な容器にエンブロヨを移し、残った液体を取り除きます。HMDSとエタノールを胚に対して1対1の割合で30分間加えます。その後、液体を取り出し、30分間純粋なHMDSを加えます。
ピペットで胚から液体を取り出し、30分間乾燥させます。小さなブラシと両面テープを使用して、腹側を上にして乾燥した胚をSEMスタブに取り付けます。金粒子コーティング用のスパッタコーティングマシンにスタブを挿入します。
SEM粒子の中で最も繊細なステップの1つは、胚をスタブに正しい向きに取り付けることです。胚がテープに着陸すると、向きはもはや変更できません。この後、コーティングされたスタブをSEM顕微鏡に入れ、真空を適用し、繊毛で胚節および脊索板細胞を観察する。
E7.75で胚を取り除いた後、氷の上のシャーレでPBSトゥイーンに入れます。化学フードの下で、固定溶液を含むマイクロ遠心分離管に胚を移す。この後、胚に触れないように気をつけて、チューブから固定剤を取り出します。
次いで、0.2%トリトンX-100を含むPBSで、エナチングシェーカーで室温で5分間、胚を3回洗浄する。胚から最後の洗浄を取り除き、PBSトリトンを含むブロッキング溶液を10%熱不活化血清で追加します。摂氏4度のヌテレーターで少なくとも2時間胚をブロックする。
次に、ブロッキングを除去し、ブロッキング溶液中で希釈した一次抗体の約1ミリリットルを添加する。胚を摂氏4度のヌテーターで一晩インキュベートする。一次抗体を取り除き、後で使用するために保存します。
次に、PBSトリトンで胚を2回リンスします。そして、ヌテットターで30分間3回洗います。洗浄を、一次抗体宿主種に対する希釈された蛍光結合二次抗体と交換してください。
そして、摂氏4度のヌテーターで一晩インキュベートします。次いで、二次抗体を除去し、PBSトリトンで胚を2回リンスする。PBSトリトンで30分間3回洗浄する前に。
最後の洗浄を、希釈された蛍光結合ファロイジンと希釈されたDAPIと汚れを室温で1時間含むPBSトリトンに置き換えます。次に、PBSトリトンで胚を2回リンスする。そして、室温で30分間PBSトリトンでそれらを洗います。
この後、PBSトリトンをPBSに置き換え、胚を氷の上に置き換えます。次に、清潔で正に帯電したスライド、カバースリップ、およびグリセロール水溶液ベースの取り付け媒体を準備します。スライド上に2枚の透明テープを15ミリメートル離して置きます。
次いで、解剖顕微鏡の下で、改変されたP200ピペットを使用して、胚をスライドに移動させる。細かい鉗子を使用して、卵黄嚢の側面に2つの完全なカットを行い、胚を展開します。次に、腹側を上にして胚を配置します。
50マイクロリットルの取り付け培地を胚に加えます。次に、取り付け用メディアのダブをカバースリップに追加します。テープの2つの部分にまたがるそれを置き、曲がった針を使用して胚の上にゆっくりとそれを下げます。
吸収性ワイプを使用して、カバースリップを移動しないように、余分な取り付けメディアを取り除きます。次に、カバースリップの側面を密封するためにマニキュアの寛大な量を使用します。最後に、走査型共焦点顕微鏡を用いて胚を観察する。
3Dビジュアライゼーションのためにカバースリップを歪める可能性があるため、胚の上に取り付けた後にカバースリップを移動しないことが重要です。走査型電子顕微鏡を用いて、E7.75で1つの変異型マウス胚を取り除いた野生型およびストリップにおける節点の形成が観察された。野生型のピット状の節とは異なり、突然変異胚は平坦化された通常の節と節状のプレートを示した。
現在、免疫蛍光に対する全体が、細胞レベルでのストリップ1変異胚におけるノードおよび脊索板形成欠陥を研究するために使用された。データは、彼らが異常であり、突然変異胚でスタントされていることを示した。ノードと節皮質プレートは、胚の表面に一時的にしか存在しないため、SEMの成功にはタイミングが不可欠です。
例えば、2~4個のスマイト胚は、長い繊毛を有する成熟した節のSEM分析に適している。純度試薬は、これらの技術の成功のためにも不可欠であり、特に胚に固執する小さな不純物が通常巨大なアーティファクトをもたらすSEMによって超構造を調査する際に不可欠である。
我々は、これら2つの技術が、正常な発達中の節および結節板の構造およびこれらの構造の形成における欠陥を示す変異体に関する補完的な情報を与える、と考えている。
