هذا البروتوكول يسمح لإنتاج نانوليبوسومات آمنة وفعالة والتي يمكن استخدامها كمركبات transfection لRNA رسول العلاجية. هذه نانوليبوسومات تسهيل امتصاص مرنا في الخلايا مما يؤدي إلى زيادة مستويات التعبير البروتين دون التأثير على صلاحية الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو توليد سريع وسهل من نانوليبوزوس مستقرة مع حجم محدد وتوزيع متجانس.
وعلاوة على ذلك، فإنها تحمي مرنا مغلفة من التدهور وتؤدي إلى الترجمة لفترات طويلة. سوف يكون إثبات الإجراء أن أنطونيا لينك، طالبة دكتوراه من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، وإعداد حلول الأسهم للدهون، DC-الكوليسترول و DOPE عن طريق حل كل في الكلوروفورم إلى تركيز النهائي من 25 ملليغرام لكل ملليلتر.
مزيج 40 ميكرولترات من الكولسترول DC الذائبة مع 80 ميكرولترات من DOPE الذائبة في قارورة زجاجية. اتبخر الكلوروفورم تحت تدفق غاز الأرجون لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، املأ جهاز الحساسية بجل السيليكا.
ضع قارورة الزجاج المفتوحة داخل وتطبيق فراغ بين عشية وضحاها لضمان تبخر الكلوروفورم المتبقية. سوف تشكل الفيلم الدهون الناتجة داخل قارورة الزجاج. في اليوم التالي، إضافة ملليلتر واحد من المياه الحرة النوى لإعادة الترطيب في فيلم الدهون.
ودوامة التعليق لمدة 15 دقيقة. وضع تعليق في حمام سونيكيشن لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، تجميع الطارد مصغرة وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
املأ حقنة مع التعليق السائل ووضعها جانب واحد من الطارد. ضع حقنة فارغة على الجانب الآخر. اضغط على تعليق الدهون من خلال الغشاء من حقنة واحدة إلى أخرى، ما يقرب من 20-25 مرة لبثق التعليق.
ثم، تخزين نانوليبوسومات في قارورة زجاجية في أربع درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. أولاً، ذوبان الحمض النووي الاصطناعي على الجليد. دوامة مرنا المجمدة ثم الطرد المركزي قبل وقت قصير من فتح الأنبوب.
ثم، مزيج ميكروغرام واحد من مرنا الاصطناعية مع كميات مختلفة من تعليق نانوليبوسوم. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتشكيل نانوليببليكس. ثم، إضافة ملليلتر من المتوسطة الخلية العادية إلى nanolipoplex ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
قم بإعداد الخلايا قبل يوم واحد من عملية إعادة الرض. لذلك، لوحة 150، 000 A549 الخلايا في كل بئر من 12 لوحة جيدا يوم واحد قبل transfection. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والخلايا المتوسطة العادية لمدة 24 ساعة.
ثم في اليوم التالي، غسل كل بئر من الخلايا المعدة مرة واحدة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. إضافة ملليلتر واحد من خليط نانوليببليكس مستعد إلى واحدة من الآبار التي تحتوي على خلايا A549. احتضان في ظروف منتظمة لمدة 24 ساعة لتحليل كفاءة transfection، أو لمدة 24-72 ساعة لتحليل صلاحية الخلية بعد transfection.
إزالة عظمى وغسل كل جيدا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لإزالة نانوليبوسومات المتبقية. لإعداد الخلايا للخلايا، أولا إضافة 500 ميكرولترات من التربسين EDTA إلى كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق لtrypsinize الخلايا. بعد ذلك، إضافة 500 ميكرولتراترس من المتوسط العادية التي تحتوي على FBS لوقف العملية وactivate التربسين.
الطرد المركزي الخلايا في 400 مرة G لمدة خمس دقائق. وإزالة بعناية فائقة دون إزعاج بيليه الخلية. غسل الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
ثم إعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولترات من حل تثبيت الخلايا ونقلها إلى أنابيب تدفق الخلايا. استخدم مقياس تدفق الخلايا لتحليل الخلايا عند 488 نانومتر. لتحضير الخلايا للمجهر الفلوري، أضف ملليلتر من الميثانول المبرد إلى كل بئر لإصلاح الخلايا.
إضافة 500 ميكرولترات من 300 نانوموللار حل من DAPI حل في برنامج تلفزيوني لكل بئر. احتضان في الظلام لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة محلول DAPI وغسل الخلايا مرة أخرى مع الميثانول 100٪ التي تم تخزينها سابقا في ناقص 20 درجة مئوية.
استخدام المجهر الفلوريس لتحليل الخلايا باستخدام الإثارة والانبعاثات الطول الموجي هو مبين هنا. في هذه الدراسة، يتم إنشاء نانوليبوزومات مع فعالية التغليف عالية لممر رنا المعدلة صناعيا. باستخدام RNA كمية عدة، يمكن تحليل فعالية التغليف من نانوليبوسومات بعد تغليف ميكروغرام واحد من eGFP ترميز مرنا عن طريق تحليل كمية مجانية من مرنا التي لا يتم تغليفها.
بعد تغليف EGFP مرنا في كميات مختلفة من نانوليبوسومات، يمكن أن تكون محتضنة nanolipoplexes شكلت مع الخلايا في المختبر والنسبة المئوية للخلايا eGFP التعبير عن يمكن تحليلها باستخدام تدفق 24 ساعة بعد transfection. كما رأينا هنا، حتى واحد فقط ميكرولتر من حل نانوليبوسومات كافية لتحقيق نقل عالية من الخلايا invitro. عندما تكون الخلايا مع العدوى nanoliposomes التي تحتوي على Cy3 المسمى eGFP mRNA، يمكن تصور وجود الحمض النووي eGFP في السيتوبلازم، وكذلك بروتين eGFP المنتج بالفعل.
منذ نقل الخلايا باستخدام نانوليبوبليكس يمكن أن يكون لها آثار سلبية على الخلايا، تم اختبار صلاحية الخلايا بعد 24 ساعة و 72 ساعة بعد نقل. ولم يكن من الممكن اكتشاف أي آثار على قابلية الخلية للبقاء عندما عولجت الخلايا بـ 2.5 أو خمسة ميكرولترات من نانوليبيكس. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن العمل في بيئة خالية من الإيثانول في كل وقت لأن هذا يمكن أن يضر استقرار نانوليبوزو.
أثناء إعداد وخلط الكوليسترول DC مع DOPE، يجب استخدام ماصة زجاجية لتجنب تلوث الدهون الذائبة مع مكونات قابلة للذوبان من نصائح الماصات البلاستيكية. بعد هذا البروتوكول، يمكن التلاعب بـ nanoliposomes المتولدة بسهولة أثناء أو بعد التحضير. على سبيل المثال، من شأن دمج جزيئات PEG أو الأجسام المضادة المحددة أن يؤدي إلى زيادة الاستقرار أو بدء استهداف الأنسجة النشطة.
و nanoliposomes ولدت الوفاء بالجوانب اللازمة للسلامة وتسهيل امتصاص مرنا إلى الخلايا المستهدفة. يمكن أن تقدم نانوليبوسوس المعقدة مع NRNA علاجية محددة مساهمة أساسية في تطوير علاجات رواية القائمة على مرنا في مجال هندسة الأنسجة أو العلاج البديل على سبيل المثال.
