Ce protocole permet la production de nanoliposomes sûrs et efficaces qui peuvent être utilisés comme véhicules de transfection pour l’ARN messager thérapeutique. Ces nanoliposomes facilitent l’absorption de l’ARNm dans les cellules, ce qui augmente les niveaux d’expression des protéines sans affecter la viabilité cellulaire. Le principal avantage de cette technique est la génération rapide et facile de nanoliposomes stables avec une taille définie et une distribution homogène.
En outre, ils protègent l’ARNm encapsulé contre la dégradation et conduisent à une traduction prolongée. Antonia Link, doctorante de notre laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, préparer des solutions de stock pour les lipides, dc-cholestérol et DOPE en dissolvant chacun dans le chloroforme à une concentration finale de 25 milligrammes par millilitre.
Mélanger 40 microlitres du cholestérol DC dissous avec 80 microlitres du DOPE dissous dans un flacon de verre. Vaporiser le chloroforme sous un flux de gaz argon pendant 15 minutes. Ensuite, remplissez un dessiccator avec du gel de silice.
Placez le flacon de verre ouvert à l’intérieur et appliquez un vide pendant la nuit pour vous assurer que le chloroforme restant est évaporé. Le film lipidique qui en résultera se formera à l’intérieur du flacon de verre. Le lendemain, ajouter un millilitre d’eau sans nucléase pour réhydrater le film lipidique.
Et vortex de la suspension pendant 15 minutes. Placez la suspension dans un bain de sonication pendant une heure. Après cela, assembler le mini extrtruder selon les instructions des fabricants.
Remplissez une seringue avec la suspension liquide et placez-la d’un côté de l’extrème. Placez une seringue vide de l’autre côté. Appuyez sur la suspension lipidique à travers la membrane d’une seringue à l’autre, environ 20-25 fois pour extruder la suspension.
Ensuite, conservez les nanoliposomes dans un flacon de verre à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Tout d’abord, décongeler l’ARNm synthétique sur la glace. Vortex de l’ARNm congelé, puis centrifugeuse peu de temps avant l’ouverture du tube.
Ensuite, mélangez un microgramme de l’ARNm synthétique avec diverses quantités de suspension nanoliposome. Centrifugeuse brièvement et incuber à température ambiante pendant 20 minutes pour la formation de nanolipoplex. Ensuite, ajoutez millilitre de milieu cellulaire régulier au nanolipoplex et mélanger en pipetting de haut en bas.
Préparer les cellules un jour avant la transfection. Par conséquent, plaque 150.000 cellules A549 dans chaque puits d’une plaque de puits 12 un jour avant la transfection. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et milieu cellulaire régulier pendant 24 heures.
Puis le lendemain, lavez chaque puits de cellules préparées une fois avec un millilitre de PBS. Ajouter un millilitre d’un mélange de nanolipoplex préparé à l’un des puits contenant les cellules A549. Incuber à des conditions régulières pendant 24 heures pour analyser l’efficacité de la transfection, ou pendant 24-72 heures pour analyser la viabilité cellulaire après la transfection.
Retirer le supernatant et bien laver avec un millilitre de PBS pour enlever les nanoliposomes restants. Pour préparer les cellules à la cytométrie, ajoutez d’abord 500 microlitres de trypsine EDTA à chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois minutes pour trypsiniser les cellules. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu régulier contenant du FBS pour arrêter le processus et inactiver la trypsine.
Centrifuger les cellules à 400 fois G pendant cinq minutes. Et retirez soigneusement le surnatant sans déranger la pastille cellulaire. Lavez les cellules avec un millilitre de PBS.
Puis re-suspendre les cellules dans 300 microlitres de solution de fixation cellulaire et les transférer dans des tubes de cytométrie d’écoulement. Utilisez un cytomètre d’écoulement pour analyser les cellules à 488 nanomètres. Pour préparer les cellules à la microscopie par fluorescence, ajouter un millilitre de méthanol réfrigéré à chaque puits pour fixer les cellules.
Ajouter 500 microlitres d’une solution nanomolaire de 300 nanomolaires de DAPI dissous dans PBS à chaque puits. Incuber dans le noir pendant cinq minutes. Après cela, retirez la solution DAPI et lavez les cellules à nouveau avec 100% de méthanol qui était précédemment stocké à moins 20 degrés Celsius.
Utilisez un microscope à fluorescence pour analyser les cellules à l’aide des longueurs d’onde d’excitation et d’émission montrées ici. Dans cette étude, les nanoliposomes sont générés avec une efficacité élevée d’encapsulation pour l’ARNm synthétiquement modifié. À l’aide du kit de quantification de l’ARN, l’efficacité de l’encapsulation des nanoliposomes peut être analysée après l’encapsulation d’un microgramme d’ARNm codant eGFP en analysant la quantité libre d’ARNm qui n’est pas encapsulée.
Après l’encapsulation de l’ARNm EGFP en différentes quantités de nanoliposomes, les nanolipoplexes formés peuvent être incubés avec des cellules in vitro et le pourcentage de cellules exprimant l’eGFP peut être analysé à l’aide de la cytométrie du débit 24 heures après la transfection. Comme on le voit ici, même un seul microlitre de la solution nanoliposomes est suffisant pour atteindre une transfection élevée des cellules invitro. Lorsque les cellules sont transfectées avec des nanoliposomes contenant de l’ARNm EGFP étiqueté Cy3, la présence de l’ARNm eGFP dans le cytoplasme, ainsi que la protéine eGFP déjà produite, peuvent être visualisées.
Puisque la transfection des cellules utilisant des nanolipoplexes peut avoir des effets défavorables sur des cellules, la viabilité des cellules a été examinée après 24 heures et 72 heures post-transfection. Aucun effet sur la viabilité des cellules n’a pu être détecté lorsque les cellules ont été traitées avec 2,5 ou cinq microlitres de nanolipoplexes. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler de travailler dans un environnement sans éthanol tout le temps parce que cela pourrait nuire à la stabilité nanoliposome.
Tout en préparant et en mélangeant le DC-cholestérol avec DOPE, vous devriez utiliser une pipette en verre pour éviter la contamination des lipides dissous avec des composants solubles des bouts de pipette en plastique. Suivant ce protocole, les nanoliposomes générés peuvent être facilement manipulés pendant ou après la préparation. Par exemple, l’incorporation de molécules PEG ou d’anticorps spécifiques entraînerait une stabilité accrue ou lancerait un ciblage actif des tissus.
Les nanoliposomes générés remplissent les aspects de sécurité nécessaires et facilitent l’absorption de l’ARNm dans les cellules cibles. Les nanoliposomes complexes avec un ARN thérapeutique spécifique peuvent apporter une contribution essentielle au développement de nouvelles thérapeutiques à base d’ARNm dans le domaine de l’ingénierie tissulaire ou de la thérapie de remplacement par exemple.
