Bu protokol terapötik haberci RNA için transfeksiyon aracı olarak kullanılabilecek güvenli ve verimli nanoliposomes üretimine olanak sağlar. Bu nanoliposomes hücre canlılığını etkilemeden artan protein ekspresyonu düzeyleri ile sonuçlanan hücrelerde mRNA alımını kolaylaştırmak. Bu tekniğin en büyük avantajı, tanımlı boyut ve homojen dağılıma sahip hızlı ve kolay nesil kararlı nanoliposomes'tir.
Ayrıca kapsüllü mRNA'yı bozulmadan korur lar ve uzun süreli çeviriye yol açarlar. Prosedürü gösteren Antonia Link, bizim laboratuvardan bir doktora öğrencisi olacaktır. Bu prosedürü başlatmak için, lipidler için stok çözümleri hazırlamak, DC-kolesterol ve DOPE mililitre başına 25 miligram son konsantrasyona kloroform her eriterek.
40 mikrolitre çözünmüş DC-kolesterolü 80 mikrolitre çözünmüş DOPE ile bir cam şişede karıştırın. 15 dakika boyunca bir argon gaz akışı altında kloroformu buharlaştırın. Sonra, silika jel ile bir kurutucu doldurun.
Açık cam şişeyi içine yerleştirin ve kalan kloroformun buharlaşmasını sağlamak için bir gecede vakum uygulayın. Ortaya çıkan lipid film cam şişe içinde oluşacaktır. Ertesi gün, lipid film rehydrate çekirdeksiz su bir mililitre ekleyin.
Ve süspansiyonu 15 dakika girdaplayın. Süspansiyonu bir saat boyunca sonication bath'a yerleştirin. Bundan sonra, üreticilerin talimatlarına göre mini ekstrüder monte edin.
Bir şırıngayı sıvı süspansiyonla doldurun ve ekstrüzyonun bir tarafına yerleştirin. Diğer tarafa boş bir şırınga yerleştirin. Süspansiyonekstrüzstrüze yaklaşık 20-25 kez, bir şırıngadan diğerine membran üzerinden lipid süspansiyon basın.
Daha sonra nanolipoomları kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede cam bir şişede saklayın. İlk olarak, sentetik mRNA'yı buz üzerinde eritin. Vortex dondurulmuş mRNA ve kısa bir süre tüp açmadan önce santrifüj.
Daha sonra, nanolipozom süspansiyon çeşitli miktarlarda sentetik mRNA bir mikrogram karıştırın. Nanolipoplex oluşumu için 20 dakika oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj ve kuluçka. Sonra, nanolipoplex düzenli hücre orta mililitre ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme tarafından karıştırın.
Hücreleri transfeksiyondan bir gün önce hazırlayın. Bu nedenle, plaka 150, 000 A549 hücreleri transfection bir gün önce bir 12 kuyu plaka her kuyuiçine. Hücreleri %5 karbondioksit ve normal hücre ortamı ile 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatırın.
Sonra ertesi gün, pbs bir mililitre ile bir kez hazırlanan hücrelerin her iyi yıkayın. A549 hücrelerini içeren kuyulardan birine bir mililitre hazırlanmış nanolipoplex karışımı ekleyin. Transfeksiyon verimliliğini analiz etmek için 24 saat veya transfeksiyon sonrası hücrenin canlılığını analiz etmek için 24-72 saat düzenli koşullarda kuluçkaya yatırın.
Supernatant çıkarın ve kalan nanoliposomes kaldırmak için PBS bir mililitre ile her iyi yıkayın. Hücreleri sitometriye hazırlamak için, öncelikle her kuyuya 500 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri denemek için 37 derecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, işlemi durdurmak ve trypsin inaktive düzenli FBS içeren orta 500 mikrolitre ekleyin.
Hücreleri 400 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Ve dikkatlice hücre pelet rahatsız etmeden supernatant çıkarın. Hücreleri bir mililitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra hücre fiksasyon çözeltisi 300 mikrolitre hücreleri yeniden askıya ve akış sitometri tüpleri içine aktarın. 488 nanometredeki hücreleri analiz etmek için bir akış sitometresi kullanın. Floresan mikroskopisi için hücreleri hazırlamak için, hücreleri düzeltmek için her iyi soğutulmuş metanol bir mililitre ekleyin.
Her kuyuya PBS'de çözünmüş 300 nanomular dapi çözeltisinin 500 mikrolitresini ekleyin. Karanlıkta beş dakika kuluçkaya yat. Bundan sonra, DAPI çözeltisi çıkarın ve daha önce eksi 20 santigrat derece depolanan% 100 metanol ile hücreleri tekrar yıkayın.
Burada gösterilen uyarma ve emisyon dalga boylarını kullanarak hücreleri analiz etmek için bir floresan mikroskobu kullanın. Bu çalışmada, nanoliposomes sentetik modifiye mRNA için yüksek kapsülleme etkinliği ile oluşturulur. RNA sayısallaştırma kiti kullanılarak, nanoliposomes kapsülleme etkinliği kapsülleme olmayan mRNA serbest miktarı analiz edilerek eGFP kodlama mRNA bir mikrogram kapsülleme sonra analiz edilebilir.
EGFP mRNA'nın farklı miktarlarda nanoliposomezomlarda kapsüllenmesinden sonra, oluşan nanolipoplexes in vitro hücrelerle kuluçkaya yatırılabilir ve eGFP ifade eden hücrelerin yüzdesi transfeksiyon sonrası akış sitometrisi kullanılarak analiz edilebilir. Burada görüldüğü gibi, nanoliposomes çözeltisi bile sadece bir mikrolitre hücrelerin invitro yüksek transfeksiyon elde etmek için yeterlidir. Hücreler cy3 etiketli eGFP mRNA içeren nanolipoomlarla geçirildiğinde, sitoplazmada eGFP mRNA'nın varlığı ve halihazırda üretilen eGFP proteini görselleştirilebilir.
Nanolipoplexes kullanarak hücrelerin transfeksiyon hücreleri üzerinde olumsuz etkileri olabilir bu yana, hücrelerin canlılığı 24 saat ve 72 saat post-transfection sonra test edildi. Hücreler 2,5 veya 5 mikrolitre nanolipoplexes ile tedavi edildiğinde hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi tespit edilemedi. Bu yordamı denerken, bu nanolipozom istikrara zarar verebilir, çünkü her zaman etanol içermeyen bir ortamda çalışmak için hatırlamak önemlidir.
Hazırlarken ve DOPE ile DC-kolesterol karıştırırken, plastik pipet uçları çözünür bileşenleri ile çözünmüş lipidlerin kontaminasyonunu önlemek için bir cam pipet kullanmalısınız. Bu protokolü takiben, oluşturulan nanoliposomes kolayca sırasında veya hazırlık sonrasında manipüle edilebilir. Örneğin, PEG moleküllerinin veya spesifik antikorların birleştirilmesi stabilitenin artmasına veya aktif doku hedeflemesine yol açacaktır.
Oluşturulan nanoliposomes gerekli güvenlik yönlerini yerine getirmek ve hedef hücrelere mRNA alımını kolaylaştırmak. Nanoliposomes belirli bir terapötik nRNA ile karmaşık doku mühendisliği veya replasman tedavisi alanında yeni mRNA tabanlı terapötik gelişimine önemli bir katkı yapabilir.
