פרוטוקול זה מאפשר ייצור של ננו-ליפוזומים בטוחים ויעילים אשר יכולים לשמש כלי רכב transfection עבור RNA שליח טיפולית. ננו-ליפוזומים אלה מאפשרים ספיגת mRNA בתאים וכתוצאה מכך רמות ביטוי חלבון מוגברות מבלי להשפיע על הכדאיות של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא דור מהיר וקל של ננו-ליפוזומים יציבים עם גודל מוגדר והפצה הומוגנית.
יתר על כן, הם מגנים על mRNA אנקפסולציה מפני השפלה ולהוביל לתרגום ממושך. הפגנת ההליך תהיה אנטוניה לינק, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, להכין פתרונות מלאי עבור שומנים, DC-כולסטרול ו DOPE על ידי המסת כל אחד כלורופורם לריכוז סופי של 25 מיליגרם למיליליטר.
מערבבים 40 מיקרוליטרים של כולסטרול DC מומס עם 80 microliters של DOPE מומס בבקבוק זכוכית. לאדות את הכלורופורם תחת זרימת גז ארגון במשך 15 דקות. לאחר מכן, מלאו את היודשן בג'ל סיליקה.
מניחים את בקבוק הזכוכית הפתוח בפנים ולהחיל ואקום לילה כדי להבטיח כי כלורופורם הנותר מתאדה. סרט השומנים שנוצר ייווצור בתוך בקבוקון הזכוכית. למחרת, להוסיף מיליליטר אחד של מים ללא גרעין כדי rehydrate הסרט השומנים.
ומערבולת ההשעיה במשך 15 דקות. מניחים את ההשעיה לתוך אמבטיה sonication במשך שעה אחת. לאחר מכן, להרכיב את extruder מיני על פי הוראות היצרנים.
ממלאים מזרק עם ההשעיה הנוזלית ומ מניחים אותו בצד אחד של האלט. מניחים מזרק ריק בצד השני. לחץ על השעיית השומנים דרך הממברנה ממזרק אחד לשני, כ 20-25 פעמים כדי להבלט את ההשעיה.
לאחר מכן, לאחסן את nanoliposomes בבקבוק זכוכית בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. ראשית, להפשיר את mRNA סינתטי על קרח. מערבולת mRNA קפוא ולאחר מכן צנטריפוגה זה זמן קצר לפני פתיחת הצינור.
לאחר מכן, מערבבים מיקרוגרם אחד של mRNA סינתטי עם כמויות שונות של השעיה nanoliposome. צנטריפוגה לזמן קצר דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות עבור היווצרות nanolipoplex. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר של מדיום תא רגיל לננו-ליפופלקס ומערבבים על-ידי צינור למעלה ולמטה.
הכינו את התאים יום אחד לפני ההתהפוכיות. לכן, צלחת 150, 000 תאים A549 לתוך כל באר של 12 צלחת גם יום אחד לפני transfection. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני ובינוני תא רגיל במשך 24 שעות.
ואז למחרת, לשטוף כל באר של תאים מוכנים פעם אחת עם מיליליטר אחד של PBS. מוסיפים מיליליטר אחד של תערובת ננו-ליפופלקס מוכנה לאחת מה בארות המכילות את תאי A549. דגירה בתנאים קבועים במשך 24 שעות כדי לנתח את יעילות transfection, או במשך 24-72 שעות כדי לנתח את הכדאיות התא לאחר transfection.
הסר את supernatant ולשטוף כל באר עם מיליליטר אחד של PBS כדי להסיר את הננו-ליפוזומים הנותרים. כדי להכין את התאים לציטומטריה, ראשית להוסיף 500 microliters של טריפסין EDTA לכל באר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות כדי לנסות את התאים. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של מדיום רגיל המכיל FBS כדי לעצור את התהליך ולהשבית את טריפסין.
צנטריפוגה התאים ב 400 פעמים G במשך חמש דקות. ובזהירות להסיר את supernatant מבלי להפריע גלולת התא. לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS.
ואז להשעות מחדש את התאים ב 300 microliters של פתרון קיבוע התא ולהעביר אותם לתוך צינורות cytometry זרימה. השתמש בציטומטר זרימה כדי לנתח את התאים ב 488 ננומטר. כדי להכין את התאים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מוסיפים מיליליטר אחד של מתנול צונן לכל באר כדי לתקן את התאים.
הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון 300 ננומולרים של DAPI מומס PBS לכל באר. דגירה בחושך במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את פתרון DAPI ולשטוף את התאים שוב עם 100% מתנול שאוחסן בעבר במינוס 20 מעלות צלזיוס.
השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנתח את התאים באמצעות אורכי גל העירור וההפלה המוצגים כאן. במחקר זה, ננו-ליפוזומים נוצרים עם יעילות אנקפסולציה גבוהה עבור mRNA שונה לאכסון. באמצעות ערכת כימות RNA, יעילות אנקפסולציה של nanoliposomes ניתן לנתח לאחר אנקפסולציה של מיקרוגרם אחד של mRNA קידוד eGFP על ידי ניתוח הכמות החופשית של mRNA אשר אינו עקיף.
לאחר אנקפסולציה של mRNA EGFP בכמויות שונות של nanoliposomes, nanolipoplexes נוצר יכול להיות דגירה עם תאים במבחנה ואת אחוז התאים eGFP-expressing ניתן לנתח באמצעות cytometry זרימה 24 שעות לאחר ההמרה. כפי שניתן לראות כאן, אפילו רק מיקרוליטר אחד של פתרון nanoliposomes מספיק כדי להשיג transfection גבוה של התאים invitro. כאשר התאים מגולמים עם ננו-ליפוזומים המכילים Cy3 שכותרתו eGFP mRNA, נוכחות של mRNA eGFP בציטופלסמה, כמו גם חלבון eGFP המיוצר כבר, ניתן לדמיין.
מאז transfection של תאים באמצעות nanolipoplexes יכול להיות השפעות שליליות על תאים, הכדאיות של התאים נבדק לאחר 24 שעות ו 72 שעות לאחר transfection. לא ניתן היה לזהות השפעות על הכדאיות של התאים כאשר התאים טופלו עם 2.5 או חמישה מיקרוליטרים של ננו-ליפופלקסים. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בסביבה ללא אתנול כל הזמן כי זה יכול לפגוע ביציבות nanoliposome.
בעת הכנת ערבוב DC-כולסטרול עם DOPE, אתה צריך להשתמש פיפטה זכוכית כדי למנוע זיהום של שומנים מומס עם רכיבים מסיסים של טיפים פיפטה פלסטיק. בעקבות פרוטוקול זה, nanoliposomes שנוצר ניתן לתפעל בקלות במהלך או אחרי ההכנה. לדוגמה, שילוב של מולקולות PEG או נוגדנים ספציפיים יוביל ליציבות מוגברת או ליזום מיקוד רקמות פעילות.
nanoliposomes שנוצר למלא את ההיבטים הבטיחות הדרושים להקל על ספיגת mRNA לתאי היעד. Nanoliposomes מורכב עם nRNA טיפולי ספציפי יכול לתרום תרומה חיונית לפיתוח של טיפולים מבוססי mRNA הרומן בתחום הנדסת רקמות או טיפול חלופי למשל.
