Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung sicherer und effizienter Nanoliposomen, die als Transfektionsvehikel für therapeutische Boten-RNA verwendet werden können. Diese Nanoliposomen erleichtern die mRNA-Aufnahme in Zellen, was zu einer erhöhten Proteinexpression führt, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die schnelle und einfache Erzeugung stabiler Nanoliposomen mit definierter Größe und homogener Verteilung.
Darüber hinaus schützen sie die gekapselte mRNA vor Abbau und führen zu einer längeren Translation. Demonstriert wird das Verfahren von Antonia Link, einer Doktorandin aus unserem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie Lagerlösungen für die Lipide, DC-Cholesterin und DOPE durch Auflösen jeder in Chloroform auf eine endgültige Konzentration von 25 Milligramm pro Milliliter.
40 Mikroliter des gelösten DC-Cholesterins mit 80 Mikrolitern des gelösten DOPE in einem Glaskolben vermischen. Verdampfen Sie das Chloroform unter einem Argongasstrom für 15 Minuten. Als nächstes füllen Sie einen Trockenbau mit Kieselgel.
Legen Sie den offenen Glaskolben innen und tragen Sie über Nacht ein Vakuum auf, um sicherzustellen, dass die verbleibende Chloroform verdampft ist. Der resultierende Lipidfilm bildet sich im Inneren des Glaskolbens. Am nächsten Tag einen Milliliter Nuklease-freies Wasser hinzufügen, um den Lipidfilm zu rehydrieren.
Und wirbeln Sie die Federung für 15 Minuten. Legen Sie die Suspension für eine Stunde in ein Beschallungsbad. Montieren Sie anschließend den Miniextruder gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Füllen Sie eine Spritze mit der Flüssigkeitssuspension und legen Sie sie eine Seite des Extruders. Legen Sie eine leere Spritze auf die andere Seite. Drücken Sie die Lipidsuspension durch die Membran von einer Spritze zur anderen, etwa 20-25 Mal, um die Suspension zu extrudieren.
Dann lagern Sie die Nanoliposomen in einem Glaskolben bei vier Grad Celsius, bis sie einsatzbereit sind. Zuerst tauen Sie die synthetische mRNA auf Eis auf. Wirbeln Sie die gefrorene mRNA und zentrifugieren Sie sie dann kurz vor dem Öffnen des Rohres.
Mischen Sie dann ein Mikrogramm der synthetischen mRNA mit verschiedenen Mengen an Nanoliposomensuspension. Zentrifugieren Sie kurz und inkubieren bei Raumtemperatur für 20 Minuten für Nanolipoplex Bildung. Dann fügen Sie Milliliter reguläres Zellmedium zu den Nanolipoplex es und mischen Durch Pipettieren nach oben und unten.
Bereiten Sie die Zellen einen Tag vor der Transfektion vor. Daher Platte 150, 000 A549 Zellen in jeden Brunnen einer 12 WellPlatte einen Tag vor der Transfektion. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und regulärem Zellmedium für 24 Stunden.
Dann am nächsten Tag, waschen Sie jeden Brunnen von vorbereiteten Zellen einmal mit einem Milliliter PBS. Fügen Sie einen Milliliter einer vorbereiteten Nanolipoplex-Mischung in einen der Brunnen, die die A549-Zellen enthalten. Inkubieren Sie unter regelmäßigen Bedingungen für 24 Stunden, um die Transfektionseffizienz zu analysieren, oder für 24-72 Stunden, um die Zelllebensfähigkeit nach der Transfektion zu analysieren.
Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie jeden Brunnen mit einem Milliliter PBS, um die restlichen Nanoliposomen zu entfernen. Um die Zellen auf die Zytometrie vorzubereiten, fügen Sie zunächst 500 Mikroliter Trypsin EDTA zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren sie bei 37 Grad Celsius für drei Minuten, um die Zellen zu trypsinisieren. Als nächstes fügen Sie 500 Mikroliter reguläres FBS-haltiges Medium hinzu, um den Prozess zu stoppen und das Trypsin zu inaktivieren.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 mal G für fünf Minuten. Und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS.
Dann setzen Sie die Zellen in 300 Mikroliter zellfixierungslösung wieder auf und übertragen sie in Durchflusszytometrieröhrchen. Verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um die Zellen mit 488 Nanometern zu analysieren. Um die Zellen auf die Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter gekühltes Methanol hinzu, um die Zellen zu fixieren.
Fügen Sie 500 Mikroliter einer 300 Nanomolaren-Lösung von DAPI in PBS gelöst zu jedem Brunnen. Fünf Minuten im Dunkeln bebrüten. Danach entfernen Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen erneut mit 100% Methanol, das zuvor bei minus 20 Grad Celsius gelagert wurde.
Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen anhand der hier gezeigten Anregungs- und Emissionswellenlängen zu analysieren. In dieser Studie werden Nanoliposomen mit hoher Verkapselungswirksamkeit für synthetisch modifizierte mRNA erzeugt. Mit Hilfe des RNA-Quantifizierungskits kann die Verkapselungswirksamkeit der Nanoliposomen nach der Verkapselung eines Mikrogramms eGFP-Codierung mRNA analysiert werden, indem die freie Menge an mRNA analysiert wird, die nicht gekapselt ist.
Nach der Verkapselung von EGFP mRNA in verschiedenen Mengen von Nanoliposomen können die gebildeten Nanolipoplexe mit Zellen in vitro inkubiert und der Prozentsatz der eGFP-exemitten Zellen mit Durchflusszytometrie 24 Stunden nach der Transfektion analysiert werden. Wie hier zu sehen, reicht sogar nur ein Mikroliter der Nanoliposomenlösung aus, um eine hohe Transfektion der Zellen invitro zu erreichen. Wenn die Zellen mit Nanoliposomen transfiziert werden, die Cy3-markierte eGFP mRNA enthalten, kann das Vorhandensein der eGFP mRNA im Zytoplasma sowie des bereits produzierten eGFP-Proteins visualisiert werden.
Da die Transfektion von Zellen mit Nanolipoplexen nachteilige Auswirkungen auf Zellen haben kann, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen nach 24 Stunden und 72 Stunden nach der Transfektion getestet. Bei der Behandlung der Zellen mit 2,5 oder fünf MikroliterN Nanolipoplexen konnten keine Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit nachgewiesen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die ganze Zeit in einer ethanolfreien Umgebung zu arbeiten, da dies die Nanolipominstabilität beeinträchtigen könnte.
Beim Vorbereiten und Mischen des DC-Cholesterins mit DOPE sollten Sie eine Glaspipette verwenden, um eine Kontamination der gelösten Lipide mit löslichen Komponenten von Kunststoffpipettenspitzen zu vermeiden. Nach diesem Protokoll können die erzeugten Nanoliposomen während oder nach der Zubereitung leicht manipuliert werden. Beispielsweise würde die Einbeziehung von PEG-Molekülen oder spezifischen Antikörpern zu erhöhter Stabilität führen oder aktivegewebe-Targeting initiieren.
Die erzeugten Nanoliposomen erfüllen die notwendigen Sicherheitsaspekte und erleichtern die mRNA-Aufnahme in die Zielzellen. Nanoliposomen, die mit einer spezifischen therapeutischen nRNA komplex iert sind, können einen wesentlichen Beitrag zur Entwicklung neuartiger mRNA-basierter Therapeutika beispielsweise im Bereich der Gewebetechnik oder Ersatztherapie leisten.
