Этот протокол позволяет производство безопасных и эффективных нанолипосом, которые могут быть использованы в качестве трансфекции транспортных средств для терапевтических РНК посыльного. Эти нанолипосомы облегчают поглощение мРНК в клетках, что приводит к повышению уровня экспрессии белка, не влияя на жизнеспособность клеток. Основным преимуществом этой техники является быстрое и легкое генерация стабильных нанолипосом с определенным размером и однородным распределением.
Кроме того, они защищают инкапсулированную мРНК от деградации и приводят к длительному переводу. Демонстрацией процедуры будет Антония Линк, аспирант нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, подготовить фондовые растворы для липидов, DC-холестерина и DOPE путем растворения каждого в хлороформе до конечной концентрации 25 миллиграммов на миллилитр.
Смешайте 40 микролитров растворенного DC-холестерина с 80 микролитров растворенного DOPE в стеклянной колбе. Испаряйте хлороформ под потоком аргона в течение 15 минут. Затем заполните децикатор кремнеземным гелем.
Поместите открытую стеклянную колбу внутрь и нанесите вакуум на ночь, чтобы убедиться, что оставшийся хлороформ испаряется. Полученная липидная пленка сформируется внутри стеклянной колбы. На следующий день добавьте один миллилитр нуклеазы свободной воды для регидратации липидной пленки.
И вихрь подвески в течение 15 минут. Поместите суспензию в звуковую ванну на один час. После этого соберите мини экструдер в соответствии с инструкциями производителей.
Заполните шприц жидкой подвеской и поместите его с одной стороны экструдера. Поместите пустой шприц на другую сторону. Нажмите липидную суспензию через мембрану от одного шприца к другому, примерно 20-25 раз, чтобы выдавить подвеску.
Затем храните нанолипосомы в стеклянной колбе при четырех градусах цельсия до готовности к использованию. Во-первых, разморозить синтетическую мРНК на льду. Vortex замороженных мРНК, а затем центрифуги его незадолго до открытия трубки.
Затем смешайте один микрограмм синтетической мРНК с различным количеством нанолипосомной подвески. Центрифуга кратко и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут для формирования нанолипоплекса. Затем добавьте миллилитр обычной клеточной среды в нанолипоплекс и перемешайте с помощью трубок вверх и вниз.
Подготовь клетки за день до трансфекции. Таким образом, пластина 150000 A549 клеток в каждый колодец из 12 пластины хорошо за день до трансфекции. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом и обычной клеточной средой в течение 24 часов.
Затем на следующий день, мыть каждый колодец подготовленных клеток один раз с одним миллилитров PBS. Добавьте один миллилитр подготовленной нанолипоплексной смеси в одну из скважин, содержащих клетки A549. Инкубировать в обычных условиях в течение 24 часов, чтобы проанализировать эффективность трансфекции, или в течение 24-72 часов, чтобы проанализировать жизнеспособность клеток после трансфекции.
Удалите супернатант и мыть каждый хорошо с одним миллилитров PBS, чтобы удалить оставшиеся нанолипосомы. Чтобы подготовить клетки к цитометрии, сначала добавьте 500 микролитров трипсина EDTA к каждой хорошо и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение трех минут, чтобы попробовать прояснизировать клетки. Затем добавьте 500 микролитров обычной FBS-содержащей среды, чтобы остановить процесс и инактивировать трипсин.
Центрифуга клетки на 400 раз G в течение пяти минут. И осторожно удалить супернатант, не нарушая ячейки гранулы. Вымойте клетки одним миллилитром PBS.
Затем повторно приостанавливают клетки в 300 микролитров раствора фиксации клеток и передают их в трубы цитометрии потока. Используйте цитометр потока для анализа клеток на 488 нанометров. Чтобы подготовить клетки к микроскопии флуоресценции, добавьте по миллилитр охлажденного метанола к каждому хорошо, чтобы исправить клетки.
Добавьте 500 микролитров 300 наномолярных растворов DAPI, растворенных в PBS, в каждую колодец. Инкубировать в темноте в течение пяти минут. После этого удалите раствор DAPI и снова вымойте клетки 100%-ным метанолом, который ранее хранился при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Используйте флуоресцентный микроскоп для анализа клеток с помощью возбудивания и выбросов длин волн показано здесь. В этом исследовании нанолипосомы генерируются с высокой эффективностью инкапсуляции для синтетически модифицированной мРНК. Используя набор количественной оценки РНК, эффективность инкапсуляции нанолипосом можно проанализировать после инкапсуляции одного микрограмма eGFP, кодирующей мРНК, анализируя свободное количество мРНК, которое не инкапсулировано.
После инкапсуляции EGFP mRNA в различных количествах нанолипосом, сформированные нанолипоплексы могут быть инкубированы клетками in vitro и процент eGFP-экспресс-экспрессии клеток может быть проанализирован с помощью цитометрии потока 24 часов после трансфекции. Как видно здесь, даже одного микролицера раствора нанолипосом достаточно для достижения высокой трансфекции клеток invitro. Когда клетки трансфицированы нанолипосомами, содержащими Cy3 помеченную eGFP mRNA, присутствие мРНК eGFP в цитоплазме, а также уже произведенный белок eGFP, можно визуализировать.
Поскольку трансфекция клеток с использованием нанолипоплексов может оказывать неблагоприятное воздействие на клетки, жизнеспособность клеток была протестирована через 24 часа и 72 часа после трансфекции. Никакого влияния на жизнеспособность клеток не было обнаружено, когда клетки лечились 2,5 или пятью микролитров нанолипоплексов. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы работать в среде, свободной от этанола все время, потому что это может нанести ущерб нанолипосомной стабильности.
При подготовке и смешивании DC-холестерина с DOPE, вы должны использовать стеклянную пипету, чтобы избежать загрязнения растворенных липидов с растворимыми компонентами пластиковых пипеток советы. Следуя этому протоколу, генерируемые нанолипосомы можно легко манипулировать во время или после подготовки. Например, включение молекул ПЕГ или специфических антител приведет к повышению стабильности или инициирует таргетинг активных тканей.
Генерируемые нанолипосомы выполняют необходимые аспекты безопасности и облегчают поглощение мРНК в клетки-мишени. Нанолипосомы, сложные с конкретной терапевтической nRNA может внести существенный вклад в развитие новых мРНК основе терапии в области тканевой инженерии или заместительной терапии, например.
