このプロトコルは、治療メッセンジャーRNAのトランスフェクション車両として使用することができる安全で効率的なナノリポソームの生産を可能にする。これらのナノリポソームは、細胞の生存率に影響を与えることなく、タンパク質発現レベルの増加をもたらす細胞におけるmRNA取り込みを促進する。この技術の主な利点は、定義されたサイズと均質な分布を持つ安定したナノリポソームの迅速かつ容易な生成です。
さらに、カプセル化されたmRNAを分解から保護し、翻訳を長時間に導きます。この手順のデモンストレーションは、当研究室の博士課程の学生、アントニア・リンクです。この手順を開始するには, 脂質のためのストック溶液を準備します, DCコレステロールとDOPEは、クロロホルムでそれぞれを溶解することにより、25 ミリリットルあたりのミリグラムの最終濃度.
溶解したDCコレステロールの40マイクロリットルを、溶かしたDOPEの80マイクロリットルをガラスフラスコに混ぜます。アルゴンガス流下でクロロホルムを15分間気化させます。次に、デシケーターにシリカゲルを充填します。
開いたガラスフラスコを内部に入れ、残りのクロロホルムが蒸発するように一晩真空を適用します。得られた脂質膜はガラスフラスコの内部に形成される。翌日、1ミリリットルのヌクレアーゼフリー水を加えて、脂質膜を水分補給する。
そして、15分間サスペンションをボルテックスします。1時間の超音波浴にサスペンションを置きます。この後、メーカーの指示に従ってミニ押出機を組み立てます。
シリンジに液体懸濁液を充填し、押出機の片側に置きます。反対側に空の注射器を置きます。脂質懸濁液を膜内の一方のシリンジから他方へ、約20~25回押し出して懸濁液を押し出す。
その後、ナノリポソームをガラスフラスコに4°Cで保存し、使用する準備ができるまで保管します。まず、合成mRNAを氷の上で解凍する。凍結したmRNAをボルテックスし、チューブを開く直前に遠心分離する。
次いで、合成mRNAの1マイクログラムを様々な量のナノリポソーム懸濁液と混合する。ナノリポプレックス形成のために、遠心分離機を室温で20分間インキュベートする。その後、通常の細胞培地のミリリットルをナノリポプレックスに加え、上下にピペットして混ぜます。
トランスフェクションの1日前に細胞を準備します。したがって、プレート150,000A549細胞は、トランスフェクションの1日前に12ウェルプレートの各ウェルに入る。5%の二酸化炭素と通常の細胞培地で37°Cで細胞を24時間インキュベートします。
そして翌日、調製した細胞の各ウェルを1ミリリットルのPBSで1回洗います。調製したナノリポプレックス混合物の1ミリリットルをA549細胞を含むウェルの1つに加えます。トランスフェクション効率を分析するために、通常の条件で24時間インキュベートし、または24〜72時間、トランスフェクション後の細胞生存率を分析します。
上清を取り除き、PBSを1ミリリットルずつよく洗い、残りのナノリポソームを取り除きます。細胞をサイトメトリー用に調製するには、まず500マイクロリットルのトリプシンEDTAを各ウェルに加え、37°Cで3分間インキュベートして細胞をトリプシン化します。次に、500マイクロリットルの通常のFBS含有培地を加えてプロセスを停止し、トリプシンを不活性化する。
5分間Gの400倍で細胞を遠心分離する。そして、細胞ペレットを邪魔することなく、上清を慎重に除去します。PBSの1ミリリットルで細胞を洗います。
その後、細胞固定液の300マイクロリットルで細胞を再中断し、フローサイトメトリーチューブに転送します。フローサイトメーターを使用して、488ナノメートルで細胞を分析します。蛍光顕微鏡用の細胞を準備するには、各ウェルに冷やしたメタノールを1ミリリットル加えて細胞を固定します。
PBSに溶解したDAPIの300ナノモル溶液を500マイクロリットルずつ加えて各ウェルに溶解します。暗闇の中で5分間インキュベートします。この後、DAPI溶液を取り出し、以前にマイナス20度で保存した100%メタノールで細胞を再び洗浄します。
蛍光顕微鏡を使用して、ここに示す励起波長と発光波長を使用して細胞を解析します。本研究では、合成修飾mRNAに対する高いカプセル化効果を有するナノリポソームが生成される。RNA定量キットを用いて、ナノリポソームのカプセル化有効性を、カプセル化されていないmRNAの自由量を分析することによって、eGFPコードmRNAの1マイクログラムのカプセル化後に分析することができる。
異なる量のナノリポソームでEGFP mRNAをカプセル化した後、形成されたナノリポプレックスをインビトロの細胞と共にインキュベートすることができ、eGFP発現細胞の割合は、トランスフェクション後24時間のフローサイトメトリーを使用して分析することができる。ここで見られるように、ナノリポソーム溶液の1マイクロリットルであっても、細胞インビトロの高いトランスフェクションを達成するのに十分である。細胞がcy3を含むナノリポソームをトランスフェクトする場合には、eGFP mRNAを標識したeGFP mRNAを細胞質に、ならびに既に産生したeGFPタンパク質に存在させることが、可視化できる。
ナノリポプレックスを用いた細胞のトランスフェクションは細胞に悪影響を及ぼす可能性があるため、トランスフェクション後24時間72時間後に細胞の生存率を試験した。細胞が2.5または5マイクロリットルのナノリポプレックスで処理された場合、細胞生存率に対する影響は検出できなかった。この手順を試みるとき、これはナノリポソームの安定性を損なう可能性があるため、常にエタノールフリーの環境で作業することを覚えておくことが重要です。
DCコレステロールとDOPEを調製し混合する際には、溶解した脂質とプラスチックピペットチップの可溶性成分の汚染を避けるために、ガラスピペットを使用する必要があります。このプロトコルに従って、生成されたナノリポソームは、調製中または調製後に容易に操作することができる。例えば、PEG分子または特異的抗体の組み込みは、安定性の向上または活性組織標的化を開始するであろう。
生成されたナノリポソームは、必要な安全性の側面を満たし、標的細胞へのmRNA取り込みを容易にする。特定の治療nRNAと複合体化したナノリポソームは、例えば組織工学または置換療法の分野における新規mRNAベースの治療薬の開発に不可欠な貢献をすることができる。
