Este protocolo permite la producción de nanoliposomas seguros y eficientes que se pueden utilizar como vehículos de transfección para EL ARN mensajero terapéutico. Estos nanoliposomas facilitan la absorción de ARNm en las células, lo que resulta en un aumento de los niveles de expresión de proteínas sin afectar la viabilidad celular. La principal ventaja de esta técnica es la generación rápida y fácil de nanoliposomas estables con tamaño definido y distribución homogénea.
Además, protegen el ARNm encapsulado de la degradación y conducen a una traducción prolongada. Demostrar el procedimiento estará Antonia Link, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, preparar soluciones de stock para los lípidos, COLESTEROL DC y DOPE disolviendo cada uno en cloroformo a una concentración final de 25 miligramos por mililitro.
Mezclar 40 microlitros del colesterol DC disuelto con 80 microlitros del DOPE disuelto en un matraz de vidrio. Vaporizar el cloroformo bajo un flujo de gas argón durante 15 minutos. A continuación, llene un desecador con gel de sílice.
Coloque el matraz de vidrio abierto dentro y aplique un vacío durante la noche para asegurarse de que el cloroformo restante se evapora. La película lipídica resultante se formará dentro del matraz de vidrio. Al día siguiente, añadir un mililitro de agua libre de nucleasas para rehidratar la película lipídica.
Y vórtice la suspensión durante 15 minutos. Coloque la suspensión en un baño de sonicación durante una hora. Después de esto, montar el mini extrusor de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Llene una jeringa con la suspensión líquida y colóquela a un lado del extrusor. Coloque una jeringa vacía en el otro lado. Presione la suspensión de lípidos a través de la membrana de una jeringa a la otra, aproximadamente 20-25 veces para extruir la suspensión.
A continuación, guarde los nanoliposomas en un matraz de vidrio a cuatro grados Centígrados hasta que estén listos para usar. Primero, descongela el ARNm sintético sobre hielo. Vórtice el ARNm congelado y luego centrifugarlo poco antes de abrir el tubo.
A continuación, mezclar un microgramo del ARNm sintético con varias cantidades de suspensión nanoliposoma. Centrifugar brevemente e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos para la formación de nanolipoplex. Luego, agregue mililitro de medio celular regular al nanolipoplex y mezcle pipeteando arriba y abajo.
Prepare las células un día antes de la transfección. Por lo tanto, placa 150, 000 A549 células en cada poción de una placa de 12 pozos un día antes de la transfección. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un medio celular regular durante 24 horas.
Luego, al día siguiente, lave cada pozo de células preparadas una vez con un mililitro de PBS. Añadir un mililitro de una mezcla de nanolipoplex preparada a uno de los pozos que contienen las células A549. Incubar en condiciones regulares durante 24 horas para analizar la eficiencia de la transfección, o durante 24-72 horas para analizar la viabilidad celular después de la transfección.
Retire el sobrenadante y lave cada pozo con un mililitro de PBS para eliminar los nanolipomas restantes. Para preparar las células para la citometría, primero agregue 500 microlitros de trippsina EDTA a cada pozo e incubar a 37 grados Celsius durante tres minutos para probar las células. A continuación, agregue 500 microlitros de medio regular que contenga FBS para detener el proceso e inactivar la tripina.
Centrifugar las células a 400 veces G durante cinco minutos. Y retire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular. Lave las células con un mililitro de PBS.
Luego vuelva a suspender las células en 300 microlitros de solución de fijación celular y transfiéralas a tubos de citometría de flujo. Utilice un citómetro de flujo para analizar las células a 488 nanómetros. Para preparar las células para la microscopía de fluorescencia, agregue un mililitro de metanol refrigerado a cada pozo para fijar las células.
Añadir 500 microlitros de una solución nanomolar 300 de DAPI disuelta en PBS a cada pozo. Incubar en la oscuridad durante cinco minutos. Después de esto, retire la solución DAPI y lave las células de nuevo con 100%metanol que se almacenó previamente a menos 20 grados Celsius.
Utilice un microscopio de fluorescencia para analizar las células utilizando las longitudes de onda de excitación y emisión que se muestran aquí. En este estudio, los nanoliposomas se generan con alta eficacia de encapsulación para el ARNm modificado sintéticamente. Utilizando el kit de cuantificación de ARN, la eficacia de encapsulación de los nanoliposomas se puede analizar después de la encapsulación de un microgramo de ARNm de codificación eGFP mediante el análisis de la cantidad libre de ARNm que no está encapsulado.
Después de la encapsulación de EGFP mRNA en diferentes cantidades de nanoliposomas, los nanolipoplexos formados se pueden incubar con células in vitro y el porcentaje de células que expresan eGFP se puede analizar utilizando citometría de flujo 24 horas después de la transfección. Como se ve aquí, incluso un microlitro de la solución de nanoliposomas es suficiente para lograr una alta transfección de las células invitro. Cuando las células se trans infectan con nanoliposomas que contienen mRNA eGFP etiquetada Cy3, se puede visualizar la presencia del ARNm eGFP en el citoplasma, así como la proteína eGFP ya producida.
Dado que la transfección de células que utilizan nanolipoplexos puede tener efectos adversos en las células, la viabilidad de las células se probó después de 24 horas y 72 horas después de la transfección. No se pudieron detectar efectos sobre la viabilidad celular cuando las células fueron tratadas con 2,5 o cinco microlitros de nanolipopplexos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar en un ambiente libre de etanol todo el tiempo porque esto podría dañar la estabilidad de los nanoliposomas.
Mientras prepara y mezcla el colesterol DC con DOPE, debe utilizar una pipeta de vidrio para evitar la contaminación de los lípidos disueltos con componentes solubles de las puntas de pipeta de plástico. Siguiendo este protocolo, los nanoliposomas generados se pueden manipular fácilmente durante o después de la preparación. Por ejemplo, la incorporación de moléculas de PEG o anticuerpos específicos conduciría a una mayor estabilidad o iniciaría la orientación activa del tejido.
Los nanoliposomas generados cumplen los aspectos de seguridad necesarios y facilitan la absorción de ARNm a las células diana. Los nanoliposomas complejos con un NRNA terapéutico específico pueden hacer una contribución esencial al desarrollo de nuevas terapias basadas en ARNM en el campo de la ingeniería de tejidos o la terapia de reemplazo, por ejemplo.
