يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الفيروسات الطيور، مثل كيفية تفاعل الفيروسات المثبطة للمناعة مع الخلايا B. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا أكثر أهمية من خطوط الخلايا الخالدة المستخدمة حاليًا في المختبر. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة كيف تستجيب خلايا الدجاج لIBDV، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على ALV و REV.
هذه الطريقة تقلل من عدد الطيور في بحثنا، وانها مفيدة لثلاثة Rs، والتي تقف على استبدال، والحد، وصقل استخدام الحيوان في البحوث. في مجلس الوزراء سلامة الميكروبيولوجية، وغسل BF في 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة على الأقل ثلاث مرات. نقل الأنسجة المغسولة إلى طبق بيتري، وإضافة خمسة ملليلترات من محلول 1X collagenase D.
استخدام مقص معقمة أو شفرة مشرط لقطع BF إلى قطع التي هي أقل من خمسة ملليمترات في القطر. احتضان في 37 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف الدورية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، استخدام ماصة معقمة باستور لpirate مرارا وتكرارا الخليط لتشجيع تفكك الأنسجة.
إضافة 5 ملليلتر آخر من 1X الكولاجين D الحل إلى الأنسجة، واحتضان في 37 درجة مئوية مع التحريض لطيف الدورية لمدة 30 دقيقة أخرى. كرر هذه العملية، التعرق الخليط، إضافة حل الكولاجين D الطازجة، والاحتضان حتى يتم هضم الأنسجة تماما. لاحظ أنه لن يكون هناك حبيبات صغيرة لن تذوب أكثر.
تمرير تعليق الخلية المهضمة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في 20 ملليلتر من 1X HBBS دون الكالسيوم. أجهزة الطرد المركزي في 400 مرة ز لمدة خمس دقائق. تجاهل افرا، resuspend بيليه في 10 ملليلتر من 1X RPMI مع 5٪ FBS.
ثم، تراكب 10 ملليلتر من تعليق الخلية على رأس خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام تدرج الكثافة التي تحتوي على البولي سكروز وdiatrizoate الصوديوم. تأكد من وجود واجهة واضحة بين الطبقتين. أجهزة الطرد المركزي في 900 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
يجب أن تشكل الخلايا شريطًا عند الواجهة بين وسائط الخلية والوسائط تدرج الكثافة. بعد ذلك ، استخدم ماصة باستور العقيمة لإزالة الخلايا ونقلها إلى أنبوب يحتوي على PBS البارد. اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي لهم في 400 مرة ز لمدة خمس دقائق ومن ثم إعادة الاعتماد عليها في برنامج تلفزيوني الباردة.
كرر هذا الغسيل ثلاث مرات. أولاً، جهاز الطرد المركزي تعليق الخلية في 400 مرة ز لمدة خمس دقائق. resuspend الخلايا في 30 ملليلتر من 1X IMDM كاملة.
تأخذ aliquot من تعليق الخلية، وإضافته إلى حل الأزرق Trypan. حساب عدد الخلايا القابلة للتطبيق التي تستبعد الأزرق Trypan، وتحديد عدد الخلايا والنسبة المئوية للقابلية للحياة. بعد ذلك، الطرد المركزي تعليق الخلية في 400 مرة ز لمدة خمس دقائق.
Resuspend الخلايا في IMDM كاملة تكمل مع تخفيف واحد إلى 20 من الدجاج CD40 ليغاند في كثافة 10 مليون خلية لكل ملليلتر. زراعة الخلايا في لوحات إما 96-أو 24-جيدا لمدة 48 إلى 72 ساعة. 48 إلى 72 ساعة بعد العزل، ذوبان aliquot من الفيروس.
دوامة العينة، وتخزينها على الجليد. إعادة تعليق الخلايا البورسيل الأساسية في المتوسط IMDM. اتخاذ 10 ميكرولتر aliquot من تعليق الخلية، وإضافته إلى 10 ميكرولترات من حل Trypan الأزرق.
ثم، تحديد عدد الخلايا والنسبة المئوية للصلاحية. تمييع الفيروس في 1X IMDM كاملة إلى التعدد المناسب من العدوى لجعل الفيروس inoculum. اخلطي هذا التخفيف عن طريق الدوامة.
الطرد المركزي تعليق الخلية في 400 مرة ز لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، إزالة ناظر، وإعادة تعليق الخلايا في الفيروس inoculum. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع الانفعالات الدورية.
بعد ذلك، الطرد المركزي تعليق الخلية في 400 مرة ز لمدة خمس دقائق. إزالة الفيروس inoculum، وغسل الخلايا في 1X كاملة IMDM وسائل الإعلام. ثقافة الخلايا في لوحات إما 96-أو 24-جيدا.
في هذه الدراسة, خلايا الجراب الأولية الدجاج هي على التوالي مثقفة السابقين في وجود الدجاج القابل للذوبان CD40 ليغاند. الخلايا المستزرعة في وجود الدجاج القابل للذوبان CD40 ligand وينظر إلى زيادة أربعة أضعاف من 902, 000 إلى 3.63 مليون لكل ملليلتر على مدى فترة ستة أيام. كما تحسنت بشكل كبير الخلية البقاء في وجود الدجاج CD40 ligand.
في صور المجهر confocal تمثيلية, وينظر إلى الخلايا المصابة أن يكون الفلورسيه الخضراء حول النواة, وهو ما يتفق مع وجود IBDV في السيتوبلازم. وهذا واضح لسلالات اثنين من IBDV، سلالة الخلية ثقافة تكييفها، D78، وسلالة خبيثة جدا، UK661. ثم يتم استخراج الحمض النووي الريبي في خمس ساعات و18 و24 و48 ساعة بعد العدوى ويخضع لRT-qPCR مع التمهيديات الخاصة بمنطقة محفوظة من جين IBDV VP4.
IBDV VP4 هو التعبير ينظر إلى زيادة إلى 16، 603 نسخ في 48 ساعة بعد العدوى مع D78 وإلى 38، 632 نسخة في 48 ساعة بعد الإصابة مع UK661. هذه البيانات توضح أن خلايا الجراب الأساسية الدجاج يمكن أن تدعم تكرار سلالات IBDV الخلوية المتكيفة مع ثقافة خبيثة جداً. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل RT-qPCR أو microarray أو RNA-SEQ من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية استجابة الخلايا للعدوى.
لقد قارنا كيف تستجيب الخلايا للعدوى مع سلالة مخففة وسلالة خبيثة جدا من IBDV ولدينا الآن التحقيق في كيفية استجابتها للالتهابات الفيروسية الأخرى. القدرة على زراعة هذه الخلايا يسمح لنا لدراسة جوانب من مرض المرض الفيروسات والمناعة دون الحاجة إلى إصابة الطيور. وسيكون لهذا تأثير كبير على ثلاثة Rs، استبدال، وصقل، والحد من استخدام الحيوانات في البحوث.
