يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول النمط الظاهري للماوس Peyer التصحيح معزولة T و B الخلايا الفرعية. على وجه الخصوص، مُساعد T الجريب وفئات الخلايا B المركز الجرثومي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستغني عن عدة خطوات إعداد مُجهدة مثل الهضم القائم على الكولاجين الذي يعرض جودة وهوية الخلايا اللمفاوية المعزولة للخطر.
تبدأ بوضع الماوس في موقف supine وتعقيم البطن مع 70٪ الإيثانول. جعل شق البطن في منتصف الطريق من خلال الجلد والصوانيم من العانة إلى القفص الصدري لفتح تجويف حولية وتحديد موقع ال cecum وتقاطع ileocecal. جعل قطع ممكن في تقاطع لفصل الأمعاء الدقيقة من cecum.
قطع mesentery مع مقص لإزالة بعناية الأمعاء الدقيقة بأكملها تصل إلى العضلة العاصرة البوامتر. قص تقاطع بين البواب والاثني عشر لفصل تماما الأمعاء الدقيقة من تجويف البطن ووضع الأمعاء الدقيقة المعزولة في بئر واحد من لوحة 6-well التي تحتوي على متوسط RPMI الباردة تكملها 10٪ مصل البقر الجنين، أو FBS، على الجليد. ثم، تهيج بلطف الأنسجة يدويا حتى يتم غمر جميع أجزاء في الوسط البارد.
عندما تم حصاد جميع الأمعاء، واستخدام ملقط لفهم الدهون mesenteric من حافة واحدة من الأمعاء ووضع العينة، الجانب mesenteric أسفل، على منشفة ورقية. ترطيب الجزء المعوي بأكمله مع RPMI 10٪ FBS لتجنب جفاف الأنسجة واللتصاق وتحديد مواقع بقع البير، والتي تظهر كمجاميع متعددة الفصوص البيضاء مع شكل يشبه القرنبيط على الجانب المضاد للميناتيريميك من جدار الأمعاء. لحصاد بقع البايير، استخدم مقصًا جراحيًا منحنيًا مع المنحنى الذي يواجه ًا لاستخراج كل رقعة بلطف من حدودها البعيدة والقريبة، مع الحرص على استبعاد الأنسجة المعوية المحيطة، ووضع بقع البايير في آبار فردية من لوحة 12 بئرًا تحتوي على الجليد البارد في RPMI 10٪ FBS على الجليد أثناء جمعها.
عندما تم الحصول على جميع البقع، واستخدام مقص لقطع طرف من 1 ملليمتر ماصة صغيرة بحيث القطر كبير بما يكفي لpirate بقع باير الفردية ونقل بقع بير في 150 ملليمتر أنابيب مخروطية لكل ماوس تحتوي على 25 ملليلتر من 37 درجة مئوية RPMI 10٪ FBS. ثم ضع الأنبوب في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية مع هياج مستمر عند 125-150 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. في نهاية الهياج، نقل بقع البير على 140 ميكرومتر مصفاة الخلية لكل فأر، واستخدام الطرف المطاطي من واحد 10 ملليلتر حقنة المكبس لكل لتعطيل بلطف بقع بير من خلال شبكة في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر الفردية.
شطف مصافي مع 15-20 ملليلتر من 10٪ 10٪ 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 بعد التخلص بعناية من افراط، resuspend الخلايا في ما يقرب من 1 مرات 10 إلى الخلايا 7 لكل ملليلتر من تركيز 10٪ FBS لPMI. ثم نقل 2-2.5 مرات 10 إلى الخلايا 6 لكل 200 ميكرولترات من المتوسطة إلى كل بئر من 96-جيدا لوحة أسفل وجولة الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
بعد التخلص من المابير مع نفض الغبار لطيف، وغسل أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 ميكرولترات من العازلة الدائمة. تسمية الخلايا في 100 ميكرولتررس من صبغة قابلة للإصلاح قابلة للحياة، المخفف في العازلة خالية من البروتين لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وحمايتها من الضوء، تليها 2 يغسل ومخزن تلطيخ الطازجة. بعد التخلص من supernatant، resuspend الكريات في 20 ميكرولتردات من كتلة FC لمدة 15 دقيقة الحضانة في 4 درجات مئوية، تليها إضافة 80 ميكرولترات من السطح الأولي كوكتيل الأجسام المضادة من الفائدة، لمدة 30 دقيقة على الجليد، وحمايتها من الضوء.
في نهاية حضانة الأجسام المضادة السطحية، وغسل الطرد المركزي الخلايا مرتين في حجم الزائد من العازلة تلطيخ، وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولترات من حل تلطيخ السطح الثانوي، تستكمل مع streptavidin. بعد 15 دقيقة على الجليد المحمية من الضوء، وغسل أجهزة الطرد المركزي الخلايا 2 مرات في عازلة تلطيخ جديدة وإعادة تثبيت الكريات في 200 ميكرولترات التثبيت، حل العمل permeablization لا يزيد عن 20 دقيقة حضانة على الجليد، محمية من الضوء. وفي نهاية فترة الحضانة، كان الطرد المركزي على الفور، الذي تبعه جهاز طرد مركزي في 200 ميكرولتر من العازلة per per well.
المقبل, resuspend الخلايا في 20 ميكرولترات من كتلة FC, المخفف في العازلة permeablization كما هو موضح, تليها إضافة 80 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا من الفائدة, لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة, محمية من الضوء. غسل الخلايا مع 100 ميكرولترات من العازلة permeablization، تليها غسل الثانية في 200 ميكرولترات من العازلة permeablization. ثم، resuspend الكريات في 200 ميكرولتررس من المخازلة تلطيخ، ونقل الخلايا إلى المقابلة المناسبة 5 ملليلتر تدفق أنابيب التحليل السيتومي، في حجم النهائي من 400 ميكرولترات من تلطيخ العازلة لكل أنبوب.
لا يتم توزيع بقع بير بالتساوي في جميع أنحاء الأمعاء الدقيقة ، ولكنها مترجمة بشكل أكثر كثافة نحو الأطراف البعيدة والقريبة من الأنسجة. يسهل هذا البروتوكول عزل مجموعة الخلايا اللمفاوية في اللمفوكية في Peyer التي توضح توزيعًا متشتتًا إلى الأمام ، مشابهًا لتلك التي لوحظت للبينوبات ، مع قدرة أكبر من 95٪ خلية. CD4 CD19 الخلايا الإيجابية المزدوجة تشكل حوالي 1٪ من مجموع السكان الليمفاوية في الجسم اللمفاوي في بير.
هذه التعبير عن مستويات عالية من CXCR5 و GL7، والتي، عند عدم استبعادها، يمكن أن يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة في الغاء من خلية T-مساعد الجريب والخلايا المركز الجرثومية B، على التوالي. بالمقارنة مع الأجهزة اللمفاوية الثانوية الأخرى، تظهر بقع بير نسبة أعلى بكثير من الخلايا B مركز الجراثيم، في مجموعة من 2-10٪ من مجموع السكان الخلايا B في ظل ظروف الدولة ثابتة. مثل الخلايا B مركز الجراثيم, الكسر الخلية T-المساعد الجريب أيضا يختلف في الفئران الفردية غير الممونة, مع مجموعة من 10-20٪ من المجموع, وD4 إيجابية Peyer التصحيح T-lymphocyte السكان.
كولاجيناز على أساس الهضم الأنزيمية يؤدي إلى انخفاض هائل من CXCR5 T-مساعد تعبير الخلية الجريبة, في حين ترك التعبير عن جزيئات سطح أخرى لم تتأثر. بعد هذا التطور، مهدت هذه التقنية الطريق لتحديد العوامل الخلوية الرئيسية داخل بقع البير التي تشارك في المناعة المخاطية والعضدية.
