Este método puede responder preguntas clave sobre el fenotipo de los subconjuntos de celdas T y B aislados de Parche de Peyer. En particular, las poblaciones de células B del centro germinal y del auxiliar folicular T. La principal ventaja de esta técnica es que prescinde de varios pasos de preparación laboriosos como la digestión basada en la colagenasa que comprometen la calidad y la identidad de los linfocitos aislados.
Comience colocando un ratón en la posición supina y esterilizando el abdomen con 70%etanol. Haga una incisión abdominal de línea media a través de la piel y peritoneo desde el pubis hasta la caja torácica para abrir la cavidad peritinal y localizar el cecum y la unión ileocecal. Haga el corte lo más distal posible en la unión para separar el intestino delgado del cecum.
Corta el mesentería con tijeras para extirpar cuidadosamente todo el intestino delgado hasta el esfínter pilórico. Cortar la unión entre el píloro y el duodeno para separar completamente el intestino delgado de la cavidad abdominal y colocar el intestino delgado aislado en un pozo de un plato de 6 pozos que contiene medio frío RPMI complementado con 10%suero bovino fetal, o FBS, en hielo. Luego, agita suavemente los tejidos manualmente hasta que todos los segmentos estén sumergidos en el medio frío.
Cuando todos los intestinos han sido cosechados, use fórceps para agarrar la grasa mesentérica de un borde del intestino y coloque la muestra, lado mesentérico hacia abajo, sobre una toalla de papel. Humedezca todo el segmento intestinal con RPMI 10%FBS para evitar la deshidratación y pegajosidad del tejido y localizar los parches del Peyer, que aparecen como agregados multilobulados blancos con una forma similar a la coliflor en el lado antimesentérico de la pared intestinal. Para cosechar los parches del Peyer, utilice tijeras quirúrgicas curvas con la curva hacia arriba para extirpar suavemente cada parche de sus bordes distales y proximales, teniendo cuidado de excluir el tejido intestinal circundante, y coloque los parches del Peyer en pozos individuales de una placa de 12 pozos que contiene RPMI 10% FBS helada en hielo a medida que se recogen.
Cuando se hayan adquirido todos los parches, utilice tijeras para cortar la punta de una punta de micro pipeta de 1 milímetro de modo que el diámetro sea lo suficientemente grande como para aspirar parches individuales de Peyer y transferir los parches del Peyer en tubos cónicos de 150 milímetros por ratón que contengan 25 mililitros de 37 grados Celsius RPMI 10%FBS. A continuación, coloque el tubo en un agitador orbital a 37 grados celsius con agitación continua a 125-150 RPM durante 10 minutos. Al final de la agitación, transfiera los parches del Peyer a un colador celular de 140 micrómetros por ratón, y utilice el extremo de goma de un émbolo de jeringa de 10 mililitros por animal para interrumpir suavemente los parches del Peyer a través de la malla en tubos cónicos individuales de 50 mililitros.
Enjuagar los coladores con 15-20 mililitros de RPMI frío 10%FBS y recoger las células por centrifugación. Después de descartar cuidadosamente el sobrenadante, resuspendir las células en aproximadamente 1 veces 10 a las 7a células por mililitro de RPMI 10%concentración FBS para el recuento. Luego transfiera 2-2.5 veces 10 a las 6a células por 200 microlitros de medio a cada pozo de una placa inferior redonda de 96 pozos y pelete las células por centrifugación.
Después de desechar el sobrenadante con un suave movimiento, centrífuga lavar las células en 200 microlitros de tampón de pie. Etiquetar las células en 100 microlitros de tinte de viabilidad fijable, diluidos en tampón libre de proteínas durante 30 minutos a 4 grados Centígrados, protegidos de la luz, seguidos de 2 lavados y tampón de tinción fresca. Después de desechar el sobrenadante, resuspendir los pellets en 20 microlitros de bloque FC para 15 minutos de incubación a 4 grados centígrados, seguido de la adición de 80 microlitros de cóctel de anticuerpos de superficie primaria de interés, durante 30 minutos sobre hielo, protegido de la luz.
Al final de la incubación de anticuerpos superficiales, la centrífuga lava las células dos veces en un volumen excesivo de tampón de tinción, y resuspendi los pellets en 100 microlitros de solución secundaria de tinción superficial, complementado con estreptavidina. Después de 15 minutos sobre hielo protegido de la luz, centrífuga lavar las células 2 veces en tampón de tinción fresca y resuspender los pellets en 200 microlitros de fijación, solución de trabajo de permeablización para una incubación de no más de 20 minutos en hielo, protegido de la luz. Al final de la incubación, centrifugar la placa inmediatamente, seguido de una centrífuga en 200 microlitros de tampón de permeablización por pozo.
A continuación, resuspender las células en 20 microlitros de bloque FC, diluidos en tampón de permeablización como se demostró, seguido de la adición de 80 microlitros del cóctel de anticuerpos intracelulares de interés, durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Lavar las células con 100 microlitros de tampón de permeablización, seguido de un segundo lavado en 200 microlitros de tampón de permeablización. Luego, resuspender los pellets en 200 microlitros de tampón de tinción, y transferir las células a los tubos de análisis citométricos de flujo de 5 mililitros correspondientes, en un volumen final de 400 microlitros de tampón de tinción por tubo.
Los parches de Peyer no se distribuyen uniformemente por todo el intestino delgado, pero se localizan densamente hacia los extremos distales y proximales del tejido. Este protocolo facilita el aislamiento de la población de linfocitos parche de Peyer que demuestra una distribución dispersa hacia delante, similar a la observada para los esplenocitos, con una viabilidad de células superior al 95%. Las células CD4 CD19 Double Positive constituyen aproximadamente el 1% de la población total de linfocitos parches de Peyer.
Estos expresan altos niveles de CXCR5 y GL7, que, cuando no se excluyen, pueden conducir a resultados falsos positivos en el gating de T-helper folicular y germen centro B, respectivamente. En comparación con otros órganos linfoides secundarios, los parches de Peyer exhiben una proporción significativamente mayor de células del centro germinal B, en un rango de 2-10% de la población total de células B en condiciones de estado estable. Al igual que las células B del centro germinal, la fracción folicular de células T-ayudante también varía en ratones individuales no inmunizados, con un rango de 10-20% del total, la población de linfocitos T del parche de ógrafo positivo CD4.
La digestión enzimática basada en la colagenasa conduce a una reducción masiva de la expresión celular folicular T-helper CXCR5, dejando la expresión de otras moléculas de superficie sin afectar. Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para la identificación de factores celulares clave dentro de los parches de Peyer que están involucrados en la inmunidad mucosa y humeral.
