Diese Methode kann wichtige Fragen zum Phänotyp von Maus Peyers Patch isoliertt T und B Zellteilmengen beantworten. Insbesondere follikuläre T-Helfer und Keimzentrum B-Zellpopulationen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie auf mehrere mühsame Vorbereitungsschritte wie kollagennasebasierte Verdauung verzichtet, die die Qualität und Identität der isolierten Lymphozyten beeinträchtigen.
Beginnen Sie, indem Sie eine Maus in die Supine-Position legen und den Bauch mit 70% Ethanol sterilisieren. Machen Sie einen Mittellinien-Bauchschnitt durch die Haut und Peritoneum von der Schambein bis zum Rippenkäfig, um die Peritinaalhöhle zu öffnen und das Cecum und die ileocecal Kreuzung zu lokalisieren. Machen Sie so distal wie möglich an der Kreuzung geschnitten, um den Dünndarm vom Cecum zu trennen.
Schneiden Sie die Mesentery mit einer Schere, um den gesamten Dünndarm vorsichtig bis zum pylorischen Schließmuskel zu entfernen. Schnippchen Sie die Kreuzung zwischen dem Pylorus und dem Zwölffingerdarm, um den Dünndarm vollständig aus der Bauchhöhle zu lösen und den isolierten Dünndarm in einen Brunnen einer 6-Well-Platte mit kaltem RPMI-Medium zu legen, das mit 10% fetalem Rinderserum oder FBS ergänzt wird, auf Eis. Dann rühren Sie das Gewebe vorsichtig manuell, bis alle Segmente in das kalte Medium getaucht sind.
Wenn alle Därme geerntet sind, verwenden Sie Zangen, um das mesenterische Fett eines Rands des Darms zu erfassen und die Probe, mesenterische Seite nach unten, auf ein Papiertuch zu legen. Befeuchten Sie das gesamte Darmsegment mit RPMI 10%FBS, um Gewebedehydrierung und Klebrigkeit zu vermeiden und die Peyer-Pflaster zu lokalisieren, die als weiße multilobulierte Aggregate mit einer blumenkohlartigen Form auf der anti-mesenterischen Seite der Darmwand erscheinen. Um die Peyer-Pflaster zu ernten, verwenden Sie gekrümmte chirurgische Scheren mit der Kurve nach oben, um jeden Fleck sanft von seinen distalen und proximalen Rändern zu verbrauchen, wobei darauf zu achten ist, das umgebende Darmgewebe auszuschließen, und legen Sie die Peyer-Pflaster in einzelne Brunnen einer 12-Well-Platte, die eiskalte RPMI 10%FBS auf Eis enthält, während sie gesammelt werden.
Wenn alle Patches erworben sind, verwenden Sie eine Schere, um die Spitze einer 1 Millimeter Mikropipettenspitze zu schneiden, so dass der Durchmesser groß genug ist, um einzelne Peyer-Patches zu absorbieren und die Peyer-Patches in 150 Millimeter konische Röhren pro Maus zu übertragen, die 25 Milliliter 37 Grad Celsius RPMI 10%FBS enthalten. Dann legen Sie die Röhre in einem Orbital-Shaker bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlicher Rührung bei 125-150 U/min für 10 Minuten. Am Ende der Agitation, übertragen Sie die Peyer-Patches auf 140 Mikrometer Zellsieb pro Maus, und verwenden Sie das Gummi-Ende eines 10 Milliliter SpritzenkolbenproTiers, um die Peyer-Patches durch das Netz sanft in einzelne 50-Milliliter-Konische Röhren zu unterbrechen.
Spülen Sie die Siebe mit 15-20 Milliliter kaltem RPMI 10%FBS und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Nach sorgfältiger Entsorgung des Überstandes, setzen Sie die Zellen bei etwa 1 mal 10 bis zu den 7. Zellen pro Milliliter der RPMI 10%FBS-Konzentration für die Zählung wieder aus. Dann 2-2,5 mal 10 auf die 6. Zellen pro 200 Mikroliter Medium auf jeden Brunnen einer 96-well runden Bodenplatte übertragen und die Zellen durch Zentrifugation pellet.
Nach dem Wegwerfen des Überstandes mit sanftem Flicken, Zentrifuge waschen die Zellen in 200 Mikroliter stehenden Puffer. Beschriften Sie die Zellen in 100 Mikroliter fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff, verdünnt in proteinfreiem Puffer für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius, geschützt vor Licht, gefolgt von 2 Waschungen und frischem Färbepuffer. Nach dem Wegwerfen des Überstandes, setzen Sie die Pellets in 20 Mikroliter FC Block für 15 Minuten Inkubation bei 4 Grad Celsius, gefolgt von der Zugabe von 80 Mikroliter primären Oberflächenantikörper Cocktail von Interesse, für 30 Minuten auf Eis, vor Licht geschützt.
Am Ende der Oberflächen-Antikörper-Inkubation waschen Zentrifuge die Zellen zweimal in einem überschüssigen Volumen von Färbepuffern und setzen die Pellets in 100 Mikrolitern sekundärer Oberflächenfärbungslösung, ergänzt mit Streptavidin, wieder auf. Nach 15 Minuten auf Licht geschütztem Eis waschen Zentrifuge die Zellen 2 mal in frischem Färbepuffer und setzen die Pellets in 200 Mikroliter fixierender, permeablization Arbeitslösung für eine nicht mehr als 20 Minuten Inkubation auf Eis, vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Platte sofort, gefolgt von einer Zentrifuge war in 200 Mikroliter PermeablisationPuffer pro Brunnen.
Als nächstes, resuspendieren Sie die Zellen in 20 Mikroliter FC-Block, verdünnt in Permeablization Puffer, wie gezeigt, gefolgt von der Zugabe von 80 Mikroliter des intrazellulären Antikörper-Cocktail von Interesse, für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Waschen Sie die Zellen mit 100 Mikroliter Permeablisationspuffer, gefolgt von einer zweiten Wäsche in 200 Mikroliter Permeablisationspuffer. Dann setzen Sie die Pellets in 200 Mikroliter Färbepuffer wieder auf und übertragen Sie die Zellen in die entsprechenden 5 Milliliter zytometrischen Analyseröhren, in einem Endvolumen von 400 Mikrolitern Färbepuffer pro Tube.
Peyers Pflaster sind nicht gleichmäßig im Dünndarm verteilt, sondern dichter zu den distalen und proximalen Enden des Gewebes lokalisiert. Dieses Protokoll erleichtert die Isolierung einer Peyer-Patch-Lymphozytenpopulation, die eine nach vorne gestreute Verteilung demonstriert, ähnlich wie bei Splenozyten, mit einer Zelllebensfähigkeit von mehr als 95 %. CD4 CD19 Double Positive Zellen machen etwa 1% der gesamten Peyer Patch-Lymphozytenpopulation aus.
Diese exprimieren hohe Konzentrationen von CXCR5 und GL7, die, wenn sie nicht ausgeschlossen werden, zu falsch positiven Ergebnissen bei der Vergating von T-Helfer-Follikulär- bzw. Keimzentrum B-Zellen führen können. Im Vergleich zu anderen sekundären lymphoiden Organen weisen Peyers Pflaster ein signifikant höheres Verhältnis von keimzentrierten B-Zellen auf, bei einem Bereich von 2-10% der gesamten B-Zellpopulation unter stationären Bedingungen. Wie keimzentrierte B-Zellen variiert die follikuläre T-Helfer-Zellfraktion auch bei einzelnen nicht immunisierten Mäusen, mit einem Bereich von 10-20% der Gesamtmenge, der CD4 Positive Peyer Patch T-Lymphozytenpopulation.
Kollagenase-basierte enzymatische Verdauung führt zu einer massiven Reduktion der FOLLikulären Zellexpression des CXCR5 T-Helfers, während die Expression anderer Oberflächenmoleküle nicht beeinträchtigt wird. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Identifizierung der wichtigsten zellulären Faktoren innerhalb der Peyer-Pflaster, die an Schleimhaut und Humeralimmunität beteiligt sind.
