Этот метод может ответить на ключевые вопросы о фенотипе мыши Peyer's Patch изолированных T и B клеток подмножества. В частности, фолликулярная T-помощник и зародышевой центр В-клеточных популяций. Основным преимуществом этого метода является то, что он обходится без нескольких трудоемких шагов подготовки, таких как пищеварение на основе коллагеназы, которые компрометируют качество и идентичность изолированных лимфоцитов.
Начните с размещения мыши в положении на спине и стерилизации живота с 70%этанола. Сделать средней линии брюшной разрез через кожу и брюшной полости от лобка до грудной клетки, чтобы открыть перитинальной полости и найти cecum и ileocecal соединения. Сделать как можно более дистальный разрез на стыке, чтобы отделить тонкий кишечник от cecum.
Вырезать мезентерии с ножницами, чтобы тщательно удалить весь тонкий кишечник до пилорического сфинктера. Снайп соединение между пилором и двенадцатиперстной кишки, чтобы полностью отделить тонкий кишечник от брюшной полости и поместить изолированный тонкий кишечник в один колодец 6-хорошо пластины, содержащей холодную rpMI среды дополняется 10%fetal бычьей сыворотки, или FBS, на льду. Затем осторожно агитировать ткани вручную, пока все сегменты погружены в холодную среду.
Когда все кишечники были собраны, использовать миппы, чтобы схватить мезентерический жир одного края кишечника и поместить образец, мезентерической стороне вниз, на бумажное полотенце. Смочить весь сегмент кишечника с RPMI 10%FBS, чтобы избежать обезвоживания тканей и липкость и найти патчи Пейера, которые появляются как белые многолобулированные агрегаты с цветной капустой, как форма на анти-мезентерической стороне стенки кишечника. Чтобы собрать патчи Пейера, используйте изогнутые хирургические ножницы с кривой, обращенной вверх, чтобы аккуратно вырезать каждый патч из его дистальных и проксимальных границ, заботясь, чтобы исключить окружающие кишечные ткани, и поместите патчи Пейера в отдельные колодцы 12-хорошо пластины, содержащей ледяной RPMI 10%FBS на льду, как они собраны.
Когда все патчи были приобретены, используйте ножницы, чтобы сократить кончик 1 миллиметр микро пипетки наконечник так, что диаметр достаточно велик, чтобы аспирировать отдельных патчей Пейера и передачи патчей Пейера в 150 миллиметров конических труб на мышь, содержащую 25 миллилитров 37 градусов по Цельсию RPMI 10%FBS. Затем поместите трубку в орбитальный шейкер при 37 градусах Цельсия с непрерывным возбуждением при 125-150 об/мин в течение 10 минут. В конце агитации, передача патчи Пейер на 140 микрометровых клеток ситечко на мышь, и использовать резиновый конец одного 10 миллилитров шприц поршень на животное, чтобы мягко нарушить патчи Пейер через сетку в отдельных 50 миллилитров конических труб.
Промыть ситечко 15-20 миллилитров холодного RPMI 10%FBS и собирать клетки центрифугации. После тщательного отбрасывания супернатанта, повторно использовать клетки примерно в 1 раз от 10 до 7 клеток на миллилитр RPMI 10%FBS концентрации для подсчета. Затем перенесите 2-2,5 раза по 10 на 6-й клетки на 200 микролитров среднего к каждому колодец 96-хорошо круглой нижней пластины и гранулы клеток центрифугации.
После отбрасывания супернатанта с нежным стряхивая, центрифуга мыть клетки в 200 микролитров стоящего буфера. Этикетка клеток в 100 микролитров фиксации жизнеспособности красителя, разбавленного в без белка буфера в течение 30 минут при 4 градусах по Цельсию, защищены от света, а затем 2 моет и свежие окрашивания буфера. После отбрасывания супернатанта, повторно поместить гранулы в 20 микролитров блока FC в течение 15 минут инкубации при 4 градусах по Цельсию, а затем добавление 80 микролитров первичной поверхности антител коктейль интерес, в течение 30 минут на льду, защищенный от света.
В конце поверхности инкубации антител центрифуги мыть клетки в два раза в избыточном объеме окрашивания буфера, и повторно гранулы в 100 микролитров вторичного раствора окрашивания поверхности, дополненный стрептавидин. После 15 минут на льду, защищенном от света, центрифуга промывает клетки 2 раза в свежем буфере окрашивания и повторно высасывает гранулы в 200 микролитров фиксации, пермяк работает раствором для не более чем 20-минутной инкубации на льду, защищенном от света. В конце инкубации центрифуга пластины сразу же, а затем центрифуга была в 200 микролитров буфера permeablization на колодец.
Далее, повторное использование клеток в 20 микролитров блока FC, разбавленных в буфере пермяки, как попродемонстрировано, а затем добавление 80 микролитров внутриклеточного антитела коктейль интерес, в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенные от света. Вымойте клетки 100 микролитров буфера пермяки, а затем вторую стирку в 200 микролитров буфера пермяки. Затем, повторное использование гранул в 200 микролитров окрашивания буфера, и передать клетки соответствующие 5 миллилитров потока цитометрического анализа труб, в окончательном объеме 400 микролитров окрашивания буфера на трубку.
Патчи Пейера равномерно распределены по тонкой кишке, но более плотно локализованы по отношению к дистальным и проксимальным концам ткани. Этот протокол облегчает изоляцию популяции лимфоцитов патча Пейера, которая демонстрирует рассеянное распределение сбоку, аналогичное тому, которое наблюдается для спеноцитов, с более чем 95%-клеточной жизнеспособностью. CD4 CD19 Двойные положительные клетки составляют около 1% от общей популяции лимфоцитов патча Пейера.
Они выражают высокие уровни CXCR5 и GL7, что, если не исключено, может привести к ложноположительным результатам в gating T-helper фолликулярных и зародышевых клеток центра B, соответственно. По сравнению с другими вторичными лимфоидными органами, патчи Пейера демонстрируют значительно более высокое соотношение зародышевых клеток центра В, в диапазоне 2-10% от общей популяции В-клеток в устойчивых условиях состояния. Как зародышевой центр B-клеток, фолликулярной Т-помощник клеточной фракции также варьируется в отдельных неиммунизированных мышей, с диапазоном 10-20% от общего числа, CD4 Положительный Пейер патч Т-лимфоцитов населения.
Коллагеназа на основе энзиматический пищеварения приводит к массовому сокращению CXCR5 T-helper фолликулярной экспрессии клеток, оставляя выражение других молекул поверхности без изменений. После этого развития, этот метод проложил путь для выявления ключевых клеточных факторов в патчи Пейера, которые участвуют в слизистой и плечевой иммунитет.
