この方法は、マウスペイヤーのパッチ分離TおよびB細胞サブセットの表現型に関する重要な質問に答えることができます。特に、濾胞性Tヘルパーおよび胚中心B細胞集団。この技術の主な利点は、単離されたリンパ球の品質と同一性を損なうコラゲアーゼベースの消化などのいくつかの骨の折れる調製ステップを分配することです。
まず、マウスをスピーヌ位置に置き、70%エタノールで腹部を殺菌します。皮膚を通して中線腹部切開を行い、皮膚と腹膜を胸部から肋骨ケージに入れて腹腔を開き、盲腸とイレオセカール接合部を見つけます。小腸を盲腸から分離するために、ジャンクションでできるだけ遠位に切ります。
腸間腸をはさみで切り、小腸全体を幽門括約筋まで慎重に取り除きます。ピロラスと十二指腸の間の接合部を切り取って小腸を腹腔から完全に切り離し、単離された小腸を氷の上に10%の胎児ウシ血清(FBS)を加えた冷たいRPMI培地を含む6ウェルプレートの1つの井戸に入れる。次に、すべてのセグメントが冷媒に沈むまで、組織を手動で穏やかに攪拌します。
すべての腸が収穫されたら、鉗子を使って腸の片方の縁の腸間膜脂肪をつかみ、サンプルである腸間膜側をペーパータオルの上に置きます。組織の脱水と粘着性を避け、腸壁の抗腸間膜側にカリフラワーのような形状を持つ白い多形凝集体として現れるペイヤーのパッチを見つけるために、RPMI 10%FBSで腸管セグメント全体を湿らせます。ペイヤーのパッチを収穫するには、曲線を上に向けた湾曲した外科用ハサミを使用して、周囲の腸組織を除外するように注意して、周囲の腸組織から各パッチを優しく切り離し、パイアーのパッチを氷の上に氷の上に12ウェルプレートを含む個々の井戸に配置します。
すべてのパッチが取得されたら、直径が個々のペイヤーのパッチを吸引し、37°CRPMI 10%FBSの25ミリリットルを含むマウスあたり150ミリメートルの円錐形チューブに転送するのに十分な大きさになるように、1ミリメートルマイクロピペットチップの先端を切断するためにはさみを使用してください。その後、チューブを摂氏37度の軌道シェーカーに入れ、125-150 RPMで10分間連続撹拌します。攪拌の終わりに、マウスあたり140マイクロメートルの細胞ストレーナーにペイヤーのパッチを移し、動物ごとに10ミリリットルシリンジプランジャーのゴムエンドを使用して、メッシュを通してペイアーのパッチを個々の50ミリリットル円錐形チューブに穏やかに破壊します。
15-20ミリリットルの冷たいRPMI 10%FBSでストレーナーをすすいで、遠心分離によって細胞を収集します。上清を慎重に廃棄した後、細胞を約10倍から7ミリリットルのRPMI10%FBS濃度で約10倍に再懸濁してカウントする。その後、96ウェル丸底板の各ウェルに培地の200マイクロリットル当たり6番目の細胞に2〜2.5倍の10倍を移し、遠心分離によって細胞をペレットします。
優しいフリックで上清を捨て、遠心分離機は200マイクロリットルの立ちバッファで細胞を洗浄します。100マイクロリットルの固定可能な生存率染料に細胞を標識し、タンパク質を含まないバッファーで4°Cで30分間希釈し、光から保護し、続いて2つのすきおよび新鮮な染色バッファーを使用します。上清を捨て、20マイクロリットルのFCブロックのペレットを摂氏4度で15分間インキュベートし、その後80マイクロリットルの一次表面抗体カクテルを添加し、氷上で30分間、光から保護する。
表面抗体インキュベーションの終わりに、遠心分離機は過剰な量の染色バッファーで細胞を2回洗浄し、2次表面染色液の100マイクロリットルでペレットを再懸濁し、ストレプトアビジンを補う。光から保護された氷の上で15分後、遠心分離機は新鮮な染色バッファーで細胞を2回洗浄し、200マイクロリットルの固定でペレットを再懸濁し、氷上で20分以下の浸透のための浸透作業溶液を透過させ、光から保護する。インキュベーションの終わりに、プレートを直ちに遠心分離し、続いて遠心分離機がウェル当たり200マイクロリットルのパーメアブレーションバッファーにあった。
次に、20マイクロリットルのFCブロック中の細胞を再懸濁し、実証したように透過液化緩衝液で希釈し、その後、目的とする細胞内抗体カクテルの80マイクロリットルを添加し、室温で30分間、光から保護する。100マイクロリットルのパーメアブライズバッファーで細胞を洗浄し、続いて200マイクロリットルのパーメアブライゼーションバッファーで2回目の洗浄を行います。次いで、ペレットを200マイクロリットルの染色バッファーで再懸濁し、適切な5ミリリットルのフローサイトメトリック分析チューブに細胞を移し、チューブ当たり400マイクロリットルの染色バッファーの最終体積にする。
ペイヤーのパッチは小腸全体に均等に分布していないが、組織の遠位および近位の端に向かってより密に局在化される。このプロトコルは、脾細胞に対して観察されたのと同様に、95%以上の細胞生存率を有する前方側散乱分布を示す、ペイヤーのパッチリンパ球集団の分離を促進する。CD4 CD19二重陽性細胞は、ペイアーのパッチリンパ球の総人口の約1%を占めています。
これらはCXCR5およびGL7の高レベルを発現し、これは、除外されない場合、それぞれTヘルパー濾胞および胚中心B細胞のゲーティングにおいて偽陽性の結果をもたらす可能性がある。他の二次性リンパ管器官と比較して、ペイアーのパッチは、安定状態下での全B細胞集団の2〜10%の範囲で、胚中心B細胞の有意に高い比率を示す。胚中心B細胞と同様に、濾胞性Tヘルパー細胞分率は、個々の単動マウスでも変化し、全体の10〜20%の範囲で、CD4陽性ペイアーのパッチTリンパ球集団である。
コラゲラーゼベースの酵素消化は、CXCR5 Tヘルパー濾胞細胞発現の大規模な減少をもたらし、他の表面分子の発現は影響を受けません。この開発後、この技術は、粘膜および上腕免疫に関与するペイヤーのパッチ内の主要な細胞因子の同定への道を開いた。
