Este método pode responder a perguntas-chave sobre o fenótipo dos subconjuntos isolados de células T e B do Mouse Peyer. Em particular, as populações de células celulares do centro T folicular e do centro germinal. A principal vantagem dessa técnica é que ela dispensa várias etapas de preparação de laborous, como a digestão baseada em colagenase que comprometem a qualidade e a identidade dos linfócitos isolados.
Comece colocando um rato na posição supina e esterilizando o abdômen com 70% de etanol. Faça uma incisão abdominal média através da pele e peritônio do púbis até a caixa torácica para abrir a cavidade peritina e localizar o ceco e a junção ileocecal. Faça o mais distal possível cortar na junção para separar o intestino delgado do ceco.
Corte a mesenteria com uma tesoura para remover cuidadosamente todo o intestino delgado até o esfíncter pilórico. Corte a junção entre o pilão e o duodeno para desprender completamente o intestino delgado da cavidade abdominal e coloque o intestino delgado isolado em um poço de uma placa de 6 poços contendo meio RPMI frio complementado com 10% de soro bovino fetal, ou FBS, no gelo. Em seguida, agitar suavemente os tecidos manualmente até que todos os segmentos estejam submersos no meio frio.
Quando todos os intestinos forem colhidos, use fórceps para agarrar a gordura mesentérica de uma borda do intestino e coloque a amostra, mesentérica lado para baixo, em uma toalha de papel. Umedeça todo o segmento intestinal com RPMI 10% FBS para evitar desidratação tecidual e pegajosa e localize as manchas do Peyer, que aparecem como agregados multilojados brancos com uma forma semelhante à couve-flor no lado anti-mesentérico da parede intestinal. Para colher as manchas do Peyer, use uma tesoura cirúrgica curva com a curva voltada para o consumo suave de cada remendo de suas bordas distal e proximal, tomando o cuidado de excluir o tecido intestinal circundante, e coloque as manchas do Peyer em poços individuais de uma placa de 12 poços contendo RPMI 10% FBS no gelo à medida que são coletadas.
Quando todas as manchas forem adquiridas, use uma tesoura para cortar a ponta de uma ponta de micro pipeta de 1 milímetro para que o diâmetro seja grande o suficiente para aspirar as manchas individuais de Peyer e transferir as manchas do Peyer em tubos cônicos de 150 milímetros por rato contendo 25 mililitros de 37 graus Celsius RPMI 10% FBS. Em seguida, coloque o tubo em um agitador orbital a 37 graus Celsius com agitação contínua a 125-150 RPM por 10 minutos. No final da agitação, transfira as manchas do Peyer para um coador de células de 140 micrômetros por rato, e use a extremidade de borracha de um êmbolo de 10 mililitros por animal para interromper suavemente as manchas do Peyer através da malha em tubos cônicos individuais de 50 mililitros.
Enxágüe os coador com 15-20 mililitros de RPMI frio 10% FBS e colete as células por centrifugação. Depois de descartar cuidadosamente o supernaspeuta, resuspenque as células em aproximadamente 1 vezes 10 a 7ª células por mililitro de concentração de RPMI 10% FBS para contar. Em seguida, transfira 2-2,5 vezes 10 para a 6ª células por 200 microliters de médio para cada poço de uma placa inferior redonda de 96 poços e pelota as células por centrifugação.
Depois de descartar o supernatante com movimento suave, centrífuga lava as células em 200 microliters de tampão em pé. Rotule as células em 100 microliters de corante de viabilidade fixável, diluídos em tampão livre de proteínas por 30 minutos a 4 graus Celsius, protegidos da luz, seguidos por 2 lavagens e tampão de coloração fresco. Depois de descartar o supernascer, resuspenque as pelotas em 20 microliters de bloco FC para incubação de 15 minutos a 4 graus Celsius, seguido pela adição de 80 microliters de coquetel de anticorpos de superfície primária de interesse, por 30 minutos no gelo, protegido da luz.
No final da incubação de anticorpos superficiais, a centrífuga lava as células duas vezes em um volume excessivo de tampão de coloração, e resuspenge as pelotas em 100 microliters de solução secundária de coloração da superfície, complementadas com streptavidina. Após 15 minutos no gelo protegido da luz, a centrífuga lava as células 2 vezes em tampão de coloração fresco e resuspensa as pelotas em 200 microliters de fixação, solução de trabalho de permeablização para uma incubação de no máximo 20 minutos no gelo, protegida da luz. No final da incubação, centrifugar a placa imediatamente, seguido por uma centrífuga estava em 200 microliters de tampão de permeablização por poço.
Em seguida, resuspensar as células em 20 microliters do bloco FC, diluídos em tampão de permeablização como demonstrado, seguido pela adição de 80 microliters do coquetel de anticorpos intracelular de interesse, por 30 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz. Lave as células com 100 microliters de tampão de permeablização, seguida por uma segunda lavagem em 200 microliters de tampão de permeablização. Em seguida, resuspenja as pelotas em 200 microliters de tampão de coloração, e transfira as células para os tubos de análise citométrica de fluxo correspondentes correspondentes de 5 mililitros, em um volume final de 400 microliters de tampão de coloração por tubo.
As manchas de Peyer não são distribuídas uniformemente por todo o intestino delgado, mas são localizadas de forma mais densa em direção às extremidades distal e proximal do tecido. Este protocolo facilita o isolamento da população de linfócitos de um peyer que demonstra uma distribuição dispersa para a frente, semelhante à observada para esplenócitos, com uma viabilidade celular superior a 95%. As células CD4 CD19 Double Positive constituem cerca de 1% da população total de linfócitos de Patch Peyer.
Estes expressam altos níveis de CXCR5 e GL7, que, quando não excluídos, podem levar a resultados falsos positivos na gating de células foliculares e germinais do centro B, respectivamente. Em comparação com outros órgãos linfoides secundários, as manchas de Peyer apresentam uma proporção significativamente maior de células germinais do centro B, em uma faixa de 2-10% da população total de células B em condições estáveis do estado. Como as células do centro B germinal, a fração de células foliculares de células T também varia em camundongos não imunizados individuais, com uma faixa de 10-20% do total, a população de linfócitos T do CD4 Positive Peyer.
A digestão enzimática baseada em colagem leva à redução maciça da expressão celular folicular do CXCR5 T-helper, deixando a expressão de outras moléculas superficiais não afetadas. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para a identificação dos principais fatores celulares dentro das manchas do Peyer que estão envolvidas na imunidade mucosa e humeral.
