이 방법은 혈액 고환 장벽 기능 또는 무결성에 영향을 미칠 수 있는 유전자 후보, 바이러스 또는 환경 독소에 관하여 생물학 필드의 혈액 고환 장벽에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 수술 3일 전에, 적어도 3 개의 8 주 오래 된 C57Black/6 남성 마우스를 치료 하는 킬로그램 당 5 밀리 그램 킬로그램 체중 카드뮴 염화 증 주사를 통해 매일 치료. 수술 당일, 75%에탄올 멸균 수술 부위에 깨끗한 조직을 놓고 온도조절히터를 섭씨 37도로 설정합니다.
마취 된 마우스를 조직에 배치 한 다음 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 면도기로 복부 머리를 면도하고 75 %의 에탄올로 노출된 피부를 소독하십시오. 복벽을 노출하기 위해 선소한 땀샘 위의 1센티미터 피부 절개를 만들고, 작은 집게를 사용하여 피부를 들어 올려 복막에서 0.5센티미터 절개를 합니다.
집게를 사용하여 고부와 고환 주위의 지방 패드를 검색하여 지방 패드를 조심스럽게 꺼내 서 부착 된 고환 하나를 노출하십시오. 지방 패드와 고환 아래에 9센티미터 크기의 종이를 놓고 갓 준비된 inulin-FITC 용액으로 마이크로 주입 파이펫을 적재합니다. 파이펫을 마이크로 조작기 장치에 연결하고 해부 현미경을 사용하여 튜니카 알부진 아래에 미세 주입 파이펫 팁을 부드럽게 삽입합니다.
작동 레버를 천천히 회전하여 이눌린-FITC의 20 마이크로리터를 고환의 간질로 전달합니다. 배달이 성공하면 고환이 밝은 녹색-노란색으로 바뀝니다. 즉시 복강에 고환을 반환하고, PBS의 20 마이크로 리터와 모순 된 고환을 주입, 다음 수술 봉합사와 피부를 닫습니다.
그리고 온도 성 히터의 열 패드에 마우스를 배치합니다. 주입 후 40 분, 각 마우스에서 고환을 수집하기 위해 날카로운 가위를 사용하고, 얼음 차가운 PBS의 1 밀리리터로 조직을 씻어. 다음으로, 12~24시간 동안 4°C에서 4%의 파라포름알데히드로 고환을 수정한 다음, 세척당 1%PBS의 1.5 밀리리터에서 3개의 세척이 가능합니다.
하룻밤 사이에 30% 자당 탈수 후 샘플을 개별 포함 프레임으로 옮기고 최적의 절삭 온도 화합물로 조직을 덮습니다. 저온의 온도를 섭씨 20도로 설정하고 10월이 동결될 때까지 약 10분 동안 저온저온에 프레임을 놓습니다. 그런 다음 각 내장 프레임을 각 금형에 덮을 때까지 신선한 OCT로 채웁니다.
OCT의 두 번째 층이 동결되면 각 고환의 5 마이크로 미터 두께의 단면을 획득하여 유리 현미경 슬라이드에 조직 섹션을 캡처합니다. 샘플을 이미지화하려면 먼저 실온에서 가습 된 상자에 슬라이드를 따뜻하게하십시오. 10분 후, 세척당 신선한 트리스 버퍼식 라인으로 슬라이드를 세 번 세척하고 단면도가 빛으로부터 보호되는 5분 동안 건조할 수 있도록 합니다.
먼지가 없는 종이를 사용하여 잔류 식염수를 제거하고 DAPI 보충 장착 매체로 샘플을 장착합니다. 그런 다음, 반전된 커버 슬립으로 각 샘플을 커버하고, 공초점 현미경의 20X 목표하에서 샘플을 이미지화한다. 3일간의 카드뮴 염화물 처리는 혈액 고환 장벽에 손상을 입히게 하여 기저구에서 반열성 상피의 정포 구획으로 확산됩니다.
대조적으로, 이 확산은 제어 PBS 처리 고환에서 차단됩니다. 혈액 고환 장벽 손상의 정도는 동일한 반열관의 반경에 이눌린-FITC 확산의 거리의 비율을 계산하여 결정된다. 또한, 이종고우스 리토르의 온전한 혈액 고환 장벽은 압정 구획으로 장벽을 가로 질러 이눌린 확산을 차단하고 조건부 리터 녹아웃 마우스는 이눌린 확산을 허용하는 손상된 혈액 고환 장벽을 가지고 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안, FITC는 빛에 민감한 분자이기 때문에 실험 당일에 준비된 inulin-FITC를 전달하고 빛으로부터 보호되는 조직을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술의 의미는 혈액 고환 장벽의 기능이 정자 발생에 있는 meiosis의 완성을 위한 면역 특권 micro 환경을 제공하기 때문에 손상된 정자 발생의 치료로 확장됩니다. 개발 후, 이 기술은 생식 의학 분야의 연구원들이 쥐의 불임과 불임을 탐구하는 방법을 제공합니다.
paraformaldehydes와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행 할 때 의류 및 얼굴 마스크를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.
