Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Bluttestis-Barriere von Biologie-Feldern über Genkandidaten, Viren oder Umweltgifte zu beantworten, die die Funktion oder Integrität der Bluttestis-Barriere beeinträchtigen können. Behandeln Sie drei Tage vor der Operation täglich mindestens drei acht Wochen alte C57Black/6 männliche Mäuse mit einem Cadmiumchlorid von fünf Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht mittels intraperitonealer Injektion. Legen Sie am Tag der Operation ein sauberes Gewebe über einen 75% Ethanol-sterilisierten Operationsbereich und stellen Sie eine thermostatische Heizung auf 37 Grad Celsius.
Legen Sie eine anästhesierte Maus auf das Gewebe, dann bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifung. Rasieren Sie das Bauchhaar mit einem Rasierer und desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 75% Ethanol. Machen Sie einen ein Zentimeter Hautschnitt über den Präputialdrüsen, um die Bauchwand zu belichten, und verwenden Sie kleine Zangen, um die Haut zu heben, um einen 0,5-Zentimeter-Schnitt im Peritoneum zu machen.
Verwenden Sie die Zange, um nach Fettpolstern um die Epididymis und Hoden zu suchen, sorgfältig ziehen die Fettpolster heraus, um einen angebrachten Hoden zu entblößen. Legen Sie ein neun Zentimeter großes Stück Papier unter die Fettpolster und Hoden und laden Sie eine Mikroinjektionspipette mit frisch zubereiteter Inulin-FITC-Lösung. Schließen Sie die Pipette an eine Mikromanipulatoreinheit an, und verwenden Sie ein Sezieren von Mikroskop, um die Mikroinjektionspipettenspitze vorsichtig unter die Tunika albuginea einzufügen.
Drehen Sie den Bedienhebel langsam, um 20 Mikroliter des Inulin-FITC in das Interstitium der Hoden zu liefern. Wenn die Lieferung erfolgreich ist, wird der Testis eine leuchtend grün-gelbe Farbe drehen. Kehren Sie den Hoden sofort in die Bauchhöhle zurück und injizieren Sie den kontralateralen Hoden mit 20 Mikroliter PBS, dann schließen Sie die Haut mit einer chirurgischen Naht.
Und legen Sie die Maus auf das Heatpad einer thermostatischen Heizung. 40 Minuten nach der Injektion, verwenden scharfe Schere, um die Hoden von jeder Maus zu sammeln, und waschen Sie das Gewebe in einem Milliliter eiskalte PBS. Als nächstes fixieren Sie die Hoden in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius für 12 bis 24 Stunden, gefolgt von drei Wäschen in 1,5 Millilitern von 1%PBS pro Wäsche.
Nach 30%Saccharose-Dehydrierung über Nacht, übertragen Sie die Proben in einzelne Einbettrahmen und decken Sie das Gewebe mit optimaler Schnitttemperaturverbindung ab. Stellen Sie die Temperatur eines Kryostats auf negative 20 Grad Celsius ein und legen Sie die Rahmen für etwa 10 Minuten in den Kryostat, bis das OCT eingefroren ist. Füllen Sie dann jeden Einbettrahmen mit frischem OCT, bis der gesamte Hoden in jeder Form abgedeckt ist.
Wenn die zweite Oct-Schicht eingefroren ist, erfassen Sie einen fünf Mikrometer dicken Querschnitt jedes Hodens, wobei die Gewebeabschnitte auf Glasmikroskop-Dias erfasst werden, sobald sie erhalten werden. Um die Proben abzubilden, wärmen Sie zuerst die Dias in einer befeuchteten Box bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Dias nach 10 Minuten dreimal in frischer Tris-gepufferter Saline pro Wäsche und lassen Sie die Abschnitte fünf Minuten lang lichtgeschützt trocknen.
Verwenden Sie staubfreies Papier, um Restaline zu entfernen, und montieren Sie die Proben mit DAPI-ergänztem Montagemedium. Bedecken Sie dann jede Probe mit einem invertierten Abdeckzettel, und stellen Sie die Proben unter dem 20-fachen Objektiv eines konfokalen Mikroskops ab. Drei Tage Cadmiumchloridbehandlung verursacht Schäden an der Blut-Testis-Barriere, die eine Inulin-FITC-Diffusion vom Basalfach in das apikale Fach des Seminiferepithels ermöglichen.
Im Gegensatz dazu wird diese Diffusion in kontroll-PBS-behandelten Hoden blockiert. Das Ausmaß der Bluttest-Barriereschäden wird durch Berechnung des Verhältnisses des Abstands der Inulin-FITC-Diffusion zum Radius desselben seminiferösen Tubuli bestimmt. Darüber hinaus blockiert die intakte Bluttestis-Barriere bei heterozygoten Rictor-Flocken-Knockout-Mäusen die Inulindiffusion über die Barriere in das apikale Fach, während bedingte Rictor-Knockout-Mäuse eine kompromittierte Bluttestis-Barriere besitzen, die eine Inulindiffusion ermöglicht.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, inulin-FITC am Tag des Experiments vorbereitet zu liefern und das Gewebe vor Licht zu schützen, da FITC ein lichtempfindliches Molekül ist. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der eingeschränkten Spermatogenese, da die Funktion der Bluttestis-Barriere darin besteht, eine immunprivilegierte Mikroumgebung für die Vollendung der Meiose bei der Spermatogenese zu schaffen. Nach seiner Entwicklung bietet diese Technik forschern auf dem Gebiet der Reproduktionsmedizin eine Möglichkeit, Subfertilität und Unfruchtbarkeit bei Mäusen zu erforschen.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyden extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Kleidungsstücken und Gesichtsmasken immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
