小鼠血睾丸屏障完整性的一种活体研究方法

此方法可以帮助回答生物学领域血液测试屏障中有关基因候选者、病毒或环境毒素的关键问题，这些问题可能会影响血液测试屏障功能或完整性。手术前三天，每天至少治疗三只八周大的C57Black/6雄性小鼠，通过内丙酮注射，每公斤体重5毫克的氯化镉。手术当天，在75%乙醇消毒手术区域放置一个干净的组织，并设置一个恒温加热器到37摄氏度。

将麻醉小鼠放在组织上，然后确认对手趾捏没有反应。用剃须刀剃腹部毛，用75%乙醇对裸露的皮肤进行消毒。在预腺体上方做一厘米的皮肤切口，露出腹壁，用小钳子抬起皮肤，在腹膜上做0.5厘米切口。

使用钳子搜索脂肪垫周围的表皮和睾丸，小心地拉出脂肪垫，露出一个附加的睾丸。将一张九厘米的纸放在脂肪垫和睾丸下面，用新鲜准备好的 inulin-FITC 溶液装载微注射移液器。将移液器连接到微操纵装置，并使用解剖显微镜轻轻地将微注射移液器尖端插入图尼卡 albuginea 下。

缓慢旋转操作杆，将 20 微升的 inulin-FITC 送入睾丸的中间体。如果交付成功，睾丸将变成明亮的绿黄色。立即将睾丸返回到腹腔，用 20 微升 PBS 注射反侧睾丸，然后用手术缝合线关闭皮肤。

将鼠标放在恒温加热器的热垫上。注射40分钟后，用锋利的剪刀从每只鼠标中收集睾丸，并在一毫升冰冷的PBS中清洗组织。接下来，在4摄氏度下将睾丸固定在4%的半成甲醛中，12至24小时，然后用1.5毫升洗涤，每次洗涤1%PBS。

30%蔗糖脱水过夜后，将样品转移到单独的嵌入框架中，用最佳的切削温度化合物覆盖组织。将低温恒温设置为负 20 摄氏度，并在低温恒温器中放置框架约 10 分钟，直到 OCT 冻结。然后，用新鲜的 OCT 填充每个嵌入框架，直到每个模具中覆盖整个睾丸。

当 OCT 的第二层冻结时，获取每个睾丸的五微米厚的横截面，在获得时将组织部分捕获到玻璃显微镜幻灯片上。要对样品进行成像，请先在室温下将幻灯片加热到加湿盒中。10 分钟后，每次洗涤时用新鲜的 Tris 缓冲盐水洗三次幻灯片，让部分干燥 5 分钟，防止光线。

使用无尘纸去除任何残留的盐水，并使用 DAPI 补充安装介质安装样品。然后，用倒置盖滑盖住每个样品，并在共和显微镜的 20 倍目标下对样品进行成像。三天的氯化镉处理对血性屏障造成损害，使内蛋白-FITC从基底室扩散到半硝基的层室。

相比之下，这种扩散在控制PBS处理的睾丸中被阻断。血睾丸屏障损伤的程度通过计算因努林-FITC扩散距离与同一半尼弗管的半径之比确定。此外，在异质裂解小鼠中，完整的血睾丸屏障阻断通过屏障扩散到细胞腔室，而有条件的 Rictor 敲除小鼠具有受损的血睾丸屏障，允许注射素扩散。

在尝试此程序时，重要的是要记住在实验当天准备的 inulin-FITC，并保持组织免受光，因为 FITC 是一个光敏分子。该技术的影响延伸到精子生成受损的治疗，因为血睾丸屏障的功能是提供一个免疫特权的微环境，完成精子生成中的美病。该技术在开发后，为生殖医学领域的研究人员探索小鼠的亚育不育和不孕症提供了途径。

不要忘记，使用甲状醛可能非常危险，执行此程序时应始终采取预防措施，如穿着衣服和面罩。