يسمح هذا الأسلوب بزراعة ثلاثة أنواع مختلفة من البكتيريا المغناطيسية تسمى MSR-1 و AMB-1 وMS-1. جميع أنواع المياه العذبة، وكلها من جنس المغناطيسية. وهي خطوة أولى أساسية لأي نوع من البحوث القابلة للاستنساخ التي تشمل هذه الكائنات الحية.
البكتيريا المغناطيسية لديها متطلبات الأكسجين محددة جدا، وهذا هو السبب في أنها وضعت نظام الملاحة المغناطيسي. ولذلك من المهم جداً التحكم في كمية الأكسجين المتاحة لهم. وقد تم تحسين كل من هذا البروتوكول لعدد قليل من سلالات محددة من مغنطيسية المياه العذبة.
ويمكن تحسين تفاصيله من أجل استيعاب متطلبات الأوكسجين والمواد الغذائية من البكتيريا المغنطيسية الأخرى. تثبيت خزان غاز النيتروجين بأمان على مقربة من مقاعد البدلاء التي هناك مساحة كافية لإنشاء محطة النيتروجين. ربط قطعة من أنابيب إلى الخزان الذي هو طويل بما فيه الكفاية للوصول إلى المنطقة التي سيتم بناء المحطة.
إذا لزم الأمر، وتطبيق الشريط تفلون في إخراج الخزان لتجنب أي تسرب. لبناء محطة قادرة على محتدما خمس زجاجات من المتوسط في نفس الوقت، وقطع أربع قطع من أنابيب aproximately خمسة سنتيمترات في الطول. تجميع قطع الأنابيب في خط مع ثلاثة 3-way على شكل تجهيزات بلاستيكية.
قم بتوصيل أحد طرفي هذا الخط بقطعة أنابيب في إخراج خزان النيتروجين من خلال تركيب إضافي على شكل حرف T. أضف مرفقًا بـ 90 درجة في الطرف الآخر. استخدام الشريط لإرفاق هيكل إلى قضيب معدني أفقي وضع aproximately 30 سم فوق مقاعد البدلاء.
ربط خمس قطع من أنابيب aproximately 20 سم في الطول إلى المخرجات الثلاثة من التجهيزات المثبتة. إزالة المكابس من خمس محاقن بلاستيكية ملليلتر واحد، وقطع الطرف الأكبر من هذه المحاقن، والحفاظ على الجزء تخرج فقط. ملء هذه المحاقن مع القطن، مع الحرص على عدم حزمة بإحكام جدا.
أدخل المحاقن في القطع العمودية التي يبلغ طولها 20 سنتيمترًا من الأنابيب. تشغيل الغاز، واستخدام الماء الصابون لضمان عدم وجود تسرب عندما النيتروجين يتدفق. إزالة قبعات من خمس 25 قياس الإبر وإدراج هذه الإبر في قطع 10 سم من أنابيب رقيقة.
إرفاق الإبر المعدة إلى المحاقن من محطة النيتروجين. تأكد من أن النيتروجين يتدفق عبر جميع الخطوط الخمسة، وإبقاء المحطة على أهبة الاستعداد. إعداد محلول ستراتات الحديديك 10 ملليمولار بإضافة 0.245 غرام من سترات الحديديك إلى 100 ملليلتر من الماء المقطر الأيون.
سخني واقلبي حتى يتم الحصول على حل واضح برتقالي. اتوملاف الحل باستخدام دورة قياسية من 15 دقيقة على الأقل التعرض في 121 درجة مئوية قبل تخزين محلول المخزون تعقيم في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لإعداد خمس زجاجات من متوسطة النمو السائل لMSR-1، إضافة المواد الكيميائية المدرجة في بروتوكول النص إلى الكوابر التي تحتوي على 300 ملليلتر من الماء المقطر الأيونية.
إضافة إلى السيترات الحديديك العقيمة والحلول المعدنية يجب أن يتم تنفيذها تحت شعلة ناسخ Bunsen باستخدام تقنيات معقمة. الظروف العقيمة ضرورية من أجل تجنب تلوث الثقافة بأنواع بكتيرية أخرى. بعد إضافة جميع المواد الكيميائية، ضبط درجة الH إلى 7.0 مع محلول هيدروكسيد الصوديوم الضرس واحد.
الاستغناء عن المتوسطة الطازجة في زجاجات مصل 125 ملليلتر، صب 60 ملليلتر من المتوسطة في كل زجاجة. فقاعة النيتروجين في الوسط لمدة 30 دقيقة لإزالة الأوكسجين المذاب باستخدام أنابيب صغيرة متصلة بمحطة النيتروجين. ضع سدادة مطاطية بوتيل فوق كل زجاجة، وترك فتحة صغيرة للسماح للغاز الزائد بالخروج من الزجاجة.
بعد 30 دقيقة، ختم مجعد كل زجاجة مع سدادة المعدة وختم الألومنيوم. يضمن ختم الألومنيوم أن الزجاجة لا تزال مغلقة خلال بقية البروتوكول. افصل الإبر والأنابيب الرقيقة من محطة النيتروجين واستبدلها بإبر نظيفة.
ضبط صمامات خزان النيتروجين بحيث يتم إخراج تدفق الغاز بشكل لطيف ومستمر من الخزان. الآن، أدخل واحدة من الإبر المتصلة خزان النيتروجين في زجاجة من المتوسطة من خلال سدادة المطاط. على الفور إدراج إبرة نظيفة أخرى في نفس الزجاجة.
كرر هذه الخطوة للزجاجات الأخرى، والسماح تدفق النيتروجين لمدة 30 دقيقة لاستبدال الهواء في زجاجات عن طريق النيتروجين. بعد 30 دقيقة، افصل زجاجة واحدة من محطة النيتروجين عن طريق إزالة الإبرة المقابلة. انتظر لبضع ثوان حتى ينخفض الضغط في زجاجة متوسطة إلى الضغط الجوي، وإزالة إبرة الثانية.
كرر هذه الخطوة لجميع الزجاجات المتبقية. لإعداد 120 ملليلتر من نصف المتوسط نمو متوسطة ل MSR-1، تغطية كوب مع رقائق الألومنيوم وautoclave الحل المعدة كما هو موضح في بروتوكول النص. قبل نهاية دورة الأوتوكلاف، قم بإعداد محلول سيستين 4٪ جديد وضبط درجة PH إلى 7.0 مع محلول هيدروكسيد الصوديوم المولى خمسة، كما هو موضح في بروتوكول النص.
بعد autoclaving، والسماح لليبرد المتوسطة وصولا الى 50 إلى 60 درجة مئوية، وجلب القار تحت شعلة بونسن الموقد. إزالة رقائق الألومنيوم و بسرعة إضافة المواد الكيميائية المذكورة في بروتوكول النص باستخدام تقنيات معقمة في حين اثارة بلطف. إضافة 1.2 milliliters من محلول سيستين المعقم مرشح.
بعد إضافة جميع المواد الكيميائية، ونقل المتوسطة الدافئة إلى 16 ملليلتر قبعة المسمار المعقم هانجات أنابيب. نقل 12 ملليلتر من المتوسط في كل أنبوب، وختم الأنابيب. لتطعيم السلالات MSR-1، AMB-1، وMS-1 في الوسط السائل، لهب قمم الأكسجين والزجاجات المتوسطة الطازجة عن طريق تطبيق الإيثانول على سدادات وتمريرها من خلال شعلة ناسخ بونسن.
باستخدام حقنة معقمة وإبرة، استخراج ملليلتر واحد من الأكسجين من زجاجة الأكسجين ونقلها إلى زجاجة متوسطة الطازجة. إذا كان استخدام inoculum من ثقافة أخرى نمت في زجاجة، لهب كلا الزجاجتين. ثم تلقيح ملليلتر واحد من الثقافة القديمة في الوسط الطازج.
احتضان الثقافة في 32 درجة مئوية، وتطعيمه في وسط جديد بعد أربعة إلى سبعة أيام. لتطعيم MSR-1 في تدرج الأكسجين، متوسط نصف مُكَد، تحقق من أن أنبوب المتوسطة الطازجة يعرض جهازاً معرفاً جيداً لـ OAI، متجسداً بواجهة وردية إلى عديمة اللون حوالي 1 إلى 3 سنتيمترات تحت سطح الوسط. إذا كان inoculum يأتي من آخر تركيز الأكسجين ثقافة التدرج شبه سوليد، حصاد البكتيريا عن طريق التعرق 50 ميكرولترات من الثقافة مع تلميح ماصة معقمة وضعت على الفرقة التي شكلتها البكتيريا.
تلقيح هذه البكتيريا ببطء في مكتب التحقيقات ومراجعة الحسابات في وسط جديد، وتجنب إزعاج واجهة. ختم الأنبوب والسماح للبكتيريا تنمو بين 25 درجة مئوية و 30 درجة مئوية. لضمان أن البكتيريا هي على حد سواء المغناطيسية وmodal، وضع قطرة من الثقافة على زلة غطاء المجهر.
قم بقلب زلة الغطاء، ثم قم بتثبيته على حلقة O مستريحة على شريحة زجاجية. تأكد من أن لا تلمس إسقاط الشريحة أسفل. ضع قطرة معلقة تحت المجهر والتركيز على حافة القطرة.
ضع القطب الجنوبي من المغناطيس بالقرب من تلك الحافة، ومشاهدة البكتيريا تسبح نحو الحافة. الوجه المغناطيس لجعلها تسبح في الاتجاه المعاكس. تظهر هنا زجاجات من وسائل الإعلام السائلة قبل التلقيح وبعد نمو البكتيريا.
يشير التعكر في الزجاجة الثانية إلى أن البكتيريا تنمو. هذا الفيلم تسارع مرتين يظهر النتيجة المتوقعة من تجربة قطرة معلقة لثقافة البكتيريا المغناطيسية والمغناطيسية مشروط. سبحت البكتيريا في البداية نحو حافة القطرة عند تطبيق حقل مغناطيسي.
عندما يتم عكس اتجاه الحقل من المغناطيس، سبح البكتيريا بعيدا عن الحافة حيث يتم تطبيق المجال المغناطيسي. تظهر هنا هي أنابيب من نصف المتوسط قبل التلقيح وبعد نمو البكتيريا. كما هو متوقع، تتشكل مجموعة من البكتيريا في الواجهة الأوكسية-أنوكسيك وتنتقل بمرور الوقت مع استهلاك الأكسجين وتتحرك الواجهة لأعلى.
يظهر هنا هو ميكروجراف إلكتروني تمثيلي لـ spirillum مغناطيسي. يشار إلى flagella من السهام السوداء، في حين أن الأسهم الحمراء تظهر المغنطيسية. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم جدا أن نتذكر أن البكتيريا المغناطيسية لديها متطلبات مستوى الأكسجين محددة جدا من أجل كل من تنمو بشكل صحيح وإنتاج المغنطيسية.
يوضح هذا البروتوكول كيفية التحكم في مستويات الأكسجين في وسائط النمو ومراقبتها من أجل تحقيق الظروف الدقيقة التي تفضلها هذه الكائنات. باتباع هذه الطريقة، يمكن الحصول على تركيزات عالية من الخلايا السليمة والمغناطيسية العالية. وبهذه الطريقة، يمكن إجراء التجارب التي تتطلب كميات كبيرة من البكتيريا، مثل استخراج المغنطيسية، والدراسات الجينومية والجينية، أو مراقبة الحركة الجماعية عن طريق المجهر.
إمكانية زراعة البكتيريا المغناطيسية في المختبر هو حقا ما سمح للعلماء استكشاف بطريقة منهجية الخواص الحيوية الحيوية والفيزيائية الرائعة لهذه الكائنات الحية.
