Этот метод позволяет выращивать три различных вида магнитотактических бактерий под названием MSR-1, AMB-1 и MS-1. Все пресноводные виды, и все из рода magnetospirillum. Это важный первый шаг для любого вида воспроизводимых исследований с участием этих организмов.
Магнитотактических бактерий имеют очень специфические потребности в кислороде, поэтому они разработали магнитную навигационную систему. Таким образом, очень важно контролировать количество кислорода, доступного для них. Весь этот протокол был оптимизирован для нескольких конкретных штаммов пресноводных магнитоспирилл.
Его детали могут быть оптимизированы для того, чтобы удовлетворить потребности в кислороде и питательных веществах других магнитотактических бактерий. Безопасно установите азотный бензобак рядом со скамейкой, на которой достаточно места для установки азотной станции. Подключите кусок трубки к баку, который достаточно долго, чтобы добраться до области, где станция будет построена.
При необходимости нанесите тефлоновую ленту на выход бака, чтобы избежать утечки. Чтобы построить станцию, способную пузыриться пять бутылок среды в то же время, вырезать четыре куска труб aproximately пять сантиметров в длину. Соберите кусочки труб в линию с тремя 3-путь Т-образные пластиковые фитинги.
Подключите один конец этой линии к куску труб на выходе из резервуара с азотом через дополнительную Т-образную установку. Добавьте 90-градусный локоть установки на другом конце. Используйте ленту, чтобы прикрепить конструкцию к горизонтальному металлическому стержню, расположенную на высоте около 30 сантиметров над скамейкой.
Соедините пять кусков труб длиной около 20 сантиметров с тремя выходами установленной арматуры. Удалите поршни из пяти одноми миллилитров пластиковых шприцев, и вырезать больший конец этих шприцев, сохраняя только окончил часть. Заполните эти шприцы хлопком, заботясь, чтобы не упаковать слишком плотно.
Вставьте шприцы в 20-сантиметровые вертикальные кусочки труб. Включите газ и используйте мыльную воду, чтобы убедиться, что нет утечки, когда азот течет. Удалите колпачки из пяти игл 25 калибра и вставьте эти иглы в 10-сантиметровые кусочки тонкой трубки.
Прикрепите подготовленные иглы к шприцам азотной станции. Убедитесь, что азот проходит через все пять линий, и держать станцию в режиме ожидания. Приготовьте 10-миллимолярный феррный цитратный раствор, добавив 0,245 грамма феррикового цитрата в 100 миллилитров дистиллированной деионизированной воды.
Нагрейте и перемешайте, чтобы растворить, пока оранжевый чистый раствор не будет получен. Автоклав раствора с использованием стандартного цикла, по крайней мере 15 минут воздействия при температуре 121 градусов по Цельсию перед хранением стерилизованного раствора фонда при комнатной температуре в темноте. Чтобы подготовить пять бутылок жидкой среды роста для MSR-1, добавьте химические вещества, перечисленные в текстовом протоколе, в стакан, содержащий 300 миллилитров дистиллированной деионизированной воды.
Добавление стерильных ферриковых цитратов и минеральных растворов должно выполняться под пламенем горелки Bunsen с использованием стерильных методов. Стерильные условия необходимы для того, чтобы избежать загрязнения культуры другими бактериальными видами. После добавления всех химических веществ, отрегулируйте рН до 7,0 с одним раствором гидроксида натрия моляра.
Разпределите свежеприготовленную среду в 125-миллилитровые бутылки сыворотки, наливая по 60 миллилитров среды в каждую бутылку. Пузырь азота в среду в течение 30 минут, чтобы удалить растворенный кислород с помощью небольших труб подключен к азотной станции. Поместите бутиловую резиновую пробку поверх каждой бутылки, оставляя небольшое отверстие, чтобы лишний газ вышел из бутылки.
Через 30 минут обжимной уплотнения каждой бутылки с подготовленной пробкой и алюминиевой печатью. Алюминиевая печать гарантирует, что бутылка остается запечатанной в течение остальной части протокола. Отключите иглы и тонкие трубки от азотной станции и замените их чистыми иглами.
Отрегулируйте клапаны азотного бака так, чтобы нежный, непрерывный поток газа выходил из бака. Теперь вставьте одну из игл, соединенных с азотным баком, в бутылку среды через резиновую пробку. Немедленно вставьте другую чистую иглу в ту же бутылку.
Повторите этот шаг для других бутылок, и пусть азот течет около 30 минут, чтобы заменить воздух в бутылках азотом. Через 30 минут отсоедините одну бутылку от азотной станции, удалив соответствующую иглу. Подождите несколько секунд, пока давление в бутылке среды не снизится до атмосферного давления, и удалите вторую иглу.
Повторите этот шаг для всех оставшихся бутылок. Чтобы подготовить 120 миллилитров полутвердой среды роста для MSR-1, накройте стакан алюминиевой фольгой и автоклавом раствор, подготовленный, как описано в текстовом протоколе. Незадолго до окончания цикла автоклавов подготовьтесь к свежему раствору 4%цистеин и отрегулируйте рН до 7,0 с помощью пятимоляного гидроксида натрия, как описано в текстовом протоколе.
После автоклавирования, дайте среде остыть до 50 до 60 градусов по Цельсию, и довести стакан под пламенем горелки Bunsen. Удалите алюминиевую фольгу и быстро добавьте химические вещества, перечисленные в текстовом протоколе, используя стерильные методы, осторожно помешивая. Добавьте 1,2 миллилитров фильтра стерилизованного раствора цистеин.
После добавления всех химических веществ, передача теплой среде в 16 миллилитров стерильных винт крышка Hungate труб. Перенесите 12 миллилитров среды в каждую трубку и запечатав трубки. Чтобы привить штаммы MSR-1, AMB-1 и MS-1 в жидкой среде, пламя вершины кислорода и свежие средние бутылки, применяя этанол на пробки и проходя их через пламя горелки Bunsen.
Используя стерильный шприц и иглу, извлекайте один миллилитр кислорода из бутылки кислорода и перенесите его в свежую средней бутылке. При использовании инокулума из другой культуры, выращенной в стеклянной бутылке, пламя обе бутылки. Затем привить один миллилитр старой культуры в свежую среду.
Инкубировать культуру при 32 градусах по Цельсию, и привить его в свежей среде через четыре-семь дней. Чтобы привить MSR-1 в кислородном градиенте, полутвердой среде, убедитесь, что трубка свежей среды отображает четко определенный OAI, материализованый розовым и бесцветным интерфейсом примерно на один-три сантиметра ниже поверхности среды. Если инокулум исходит от другой концентрации кислорода градиент полутвердой культуры, урожай бактерий, аспирируя 50 микролитров культуры с стерильной наконечник пипетки размещены на полосе, образованной бактериями.
Медленно прививать эти бактерии на OAI в свежей среде, избегая тревожных интерфейса. Печать трубки и пусть бактерии растут между 25 градусов по Цельсию и 30 градусов по Цельсию. Чтобы убедиться, что бактерии являются магнитными и модальными, поместите каплю культуры на крышку микроскопа скольжения.
Переверните крышку скольжения, и установить его на O-кольцо, опираясь на стеклянную горку. Убедитесь, что капля не коснется нижнего слайда. Поместите висячие капли под микроскопом и сосредоточиться на краю капли.
Поместите южный полюс магнита близко к этому краю, и смотреть бактерии плавают к краю. Переверните магнит, чтобы заставить их плавать в противоположном направлении. Здесь показаны бутылки жидкого мультимедиа до прививки и после роста бактерий.
Турбичность во второй бутылке указывает на то, что бактерии растут. Это два раза ускоренный фильм показывает ожидаемый результат подвешив падение эксперимент для модальных и магнитных магнитотактических бактерий культуры. Бактерии первоначально поплыл к краю капли, когда магнитное поле применяется.
Когда направление поля магнита обращено вспять, бактерии уплыли от края, где применяется магнитное поле. Здесь показаны трубки полутвердой среды до прививки и после роста бактерий. Как и ожидалось, группа бактерий образуется в oxic-аноксический интерфейс и мигрирует с течением времени, как кислород потребляется и интерфейс движется вверх.
Здесь показан репрезентативный электронный микрограф магнитного спирилума. Флагелла обозначена черными стрелками, в то время как красные стрелки показывают магнитосомы. При попытке этой процедуры, это очень важно помнить, что магнитотаксических бактерий имеют очень специфические требования к уровню кислорода для того, чтобы расти должным образом и производить магнитосомы.
Этот протокол показывает, как контролировать и контролировать уровень кислорода в средствах массовой информации роста для достижения микро-условий, предпочитаемых этими организмами. Следуя этому методу, можно получить высокие концентрации здоровых и высоко магнитных клеток. Таким образом, эксперименты, которые требуют большого количества бактерий могут быть выполнены, такие как магнитосома экстракции, геномных и генетических исследований, или наблюдения коллективного движения микроскопии.
Возможность выращивать магнитотаксическую бактерию в лаборатории на самом деле то, что позволило ученым изучать систематически увлекательные биохимические и физические свойства этих организмов.
